中文題目：5-ASA的腸道微生物代謝降低了其在炎癥性腸病中的臨床療效

發(fā)表期刊：nature medicine

發(fā)表時間：2023

影響因子：82.9

研究背景

炎性腸病 (IBD)是一種慢性、使人虛弱的胃腸疾病，治療失敗率較高。目前尚無系統(tǒng)的方法預測對IBD療法的反應?？寡姿幬锩郎忱海脖环Q為5-氨基水楊酸 (5-ASA)，是IBD最常用的處方療法之一，通常在結(jié)腸內(nèi)發(fā)揮作用；然而，隨著時間的推移，超過一半的IBD患者對5-ASA沒有反應或最終失去反應。因此，有必要確定并消除此類治療失敗的原因。

研究思路

研究重點

1、來自IBD患者的多組學研究確定了5-ASA的使用

利用人類微生物組項目炎癥性腸病多組學數(shù)據(jù)庫（IBDMDB，http://ibdmdb.org），對79名克羅恩?。–D）或潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者的糞便樣本進行多組學分析，共鑒定了1036個宏基因組（MGX）、440個元轉(zhuǎn)錄本（MTX）和508個非靶向代謝組（MBX），以及283個MBX-MGX對和213個MGX-MTX對。隨后針對13名新使用5-ASA的患者來確定5-ASA在體內(nèi)直接調(diào)節(jié)的特定糞便代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5-ASA使用前后中的5-ASA和N-乙酰5-ASA水平呈顯著差異，且經(jīng)5-ASA治療后，賴氨酸合成途徑中的細菌代謝產(chǎn)物—2-氨基己二酸的含量減少，煙酸代謝也發(fā)生了顯著變化。

進一步評估微生物、宿主和其他因素對這些差異顯著的代謝物的相對貢獻，最終發(fā)現(xiàn)5-ASA的藥物水平在確定5-ASA調(diào)節(jié)代謝物水平方面具有最大的預測能力（35%），其次是微生物組特征（15%）和其他宿主因素（7%）。隨后，通過另一個獨立的IBD患者隊列中鑒定并驗證了兩種可能的5-ASA衍生物—N-丙酰基5-ASA和N-丁?；?-ASA，它們的變化可以部分地由腸道微生物組來解釋。

圖1?5-ASA可直接影響糞便代謝組，并通過微生物組進行生物轉(zhuǎn)化

2、5-ASA代謝腸道微生物酶的鑒定

接下來確定參與5-ASA生物轉(zhuǎn)化的腸道微生物酶。首先對服用及未服用5-ASA的患者微生物進行轉(zhuǎn)錄組分析，最終鑒定了兩個顯著過表達的具有推定乙酰轉(zhuǎn)移酶功能的UniRef90基因簇：GNAT家族NAT（UniRef90 ID: C7H1G6）和乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶（UniRef90 ID: R6TIX3），以及四個具有乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的候選基因（IDs: R6CZ24, R5CY66, T5S060和A0A1C6JPG6）。隨后將糞便樣本分為N-乙酰5-ASA高水平和N-乙酰5-ASA低/陰性水平兩組，計算與N-乙酰5-ASA相關(guān)的每個元轉(zhuǎn)錄組基因簇的敏感性和特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了另外7個假定的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因簇與使用者的N-乙酰5-ASA水平呈正相關(guān)。最終得到的12個之前未被表征的候選乙酰轉(zhuǎn)移酶可分為硫解酶和酰基輔酶A N-?；D(zhuǎn)移酶兩組，其中酰基輔酶A NAT家族比硫解酶家族表現(xiàn)出更大的序列異質(zhì)性，且?；o酶A NAT酶幾乎都來自擬桿菌門，而硫解酶來自厚壁菌門。通過研究菌株水平的基因組，同樣發(fā)現(xiàn)了一部分普氏鐮孢菌株編碼相關(guān)的乙酰轉(zhuǎn)移酶。

圖2N-乙酰5-ASA微生物酶包括硫代酶和?；o酶A N-乙酰轉(zhuǎn)移酶

3、5-ASA失活酶生化特性的推定

為了推測硫解酶和酰基輔酶A NAT超家族具有潛在的5-ASA滅活能力，選用來自厚壁菌門的候選硫解酶CAG:176（UniRef90 ID: R6CZ24）和來自福氏假單胞菌的酰基輔酶A NAT（UniRef90 ID:C7H1G6）用于進一步的生化表征。用已知的腸道鏈球菌酶作為陽性對照，對乙?；?-ASA采用體外質(zhì)譜分析，最終證實了厚壁菌CAG:176硫解酶和F. prausnitzii?；o酶A NAT具有使用乙酰輔酶A乙?；?-ASA的能力。

隨后測試了硫解酶對其他含胺基異生素（包括5-ASA異構(gòu)體4-ASA、異煙肼、普魯卡因胺和肼屈嗪）的乙?；钚?，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)這些化合物的任何乙?；?，這表明了硫解酶的底物選擇性。此外，編碼第二個預測的硫解酶基因（R6TIX3）的Oscillibacter sp菌株KLE 1745的活培養(yǎng)物也能夠?qū)?-ASA乙?；癁镹-乙?；?-ASA。

為了深入了解厚壁菌CAG:176硫解酶（FcTHL）如何乙酰化5-ASA，將FcTHL的乙?；磁潴w晶體結(jié)構(gòu)疊加在乙?；蚪饷妇w結(jié)構(gòu)上，與來自充分表征的革蘭氏陰性分枝菌（ZrTHL）的乙酰輔酶A復合。隨后將FcTHL與NAT (PDB ID: 2PFR)的晶體結(jié)構(gòu)進行比對，進一步探究厚壁菌CAG:176硫解酶的推定活性位點是否類似于腸道鏈球菌NAT的活性位點，最終揭示了活性位點區(qū)域中的半胱氨酸和組氨酸三聯(lián)體。

圖3?5-ASA在體外的乙酰化活性的證實

4、IBD治療失敗與5-ASA代謝酶的宏基因組攜帶有關(guān)

基于臨床服用5-ASA的個體差異性，接下來檢查12種乙酰轉(zhuǎn)移酶的存在是否與5-ASA治療失敗有關(guān)。收集39名在任何時間點接受5-ASA治療及使用類固醇患者的609份糞便樣本，使用多變量邏輯回歸模型，調(diào)整與疾病風險相關(guān)了因素-年齡、性別、吸煙狀況和IBD亞型，納入每個參與者的NAT2表型來解釋宿主遺傳，最終發(fā)現(xiàn)糞便樣本中存在4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因與類固醇起始風險增加顯著相關(guān)。4種乙酰轉(zhuǎn)移酶基因有三種來自硫解酶超家族，一種來自?；o酶A超家族。且較早的發(fā)病年齡和CD與UC狀態(tài)相比，同樣與開始使用類固醇的更高風險顯著相關(guān)。但未發(fā)現(xiàn)類固醇使用風險和大腸桿菌NAT的宏基因組存在聯(lián)系。

在敏感性分析中，微生物乙酰轉(zhuǎn)移酶基因數(shù)量的增加與類固醇起始風險的增加顯著相關(guān)；從未使用過5-ASA治療的患者基因家族與類固醇的使用沒有正相關(guān)。隨后使用混合效應模型對參與者進行調(diào)整，發(fā)現(xiàn)存在三個或更多乙酰轉(zhuǎn)移酶基因也與類固醇使用風險增加相關(guān)，這在隨后在未使用類固醇的208名5-ASA使用者隊列中得到了驗證。

圖4腸道微生物5-ASA滅活乙酰轉(zhuǎn)移酶與5-ASA使用者治療失敗的更大風險相關(guān)

研究總結(jié)

本研究結(jié)果首次提供了特異性腸道代謝酶與IBD 5-ASA治療失敗之間的直接聯(lián)系，從而產(chǎn)生了直接的臨床潛力。5-ASA是UC最常用的處方藥。為了保持有效，它必須以未修飾的形式存在于結(jié)腸腔中，因此，與其他藥物不同，它在小腸中的吸收很差。5-ASA治療失敗的個體通常進展為風險更高的免疫抑制治療，而只有在必要時 (即腸道微生物組中存在修飾5-ASA的硫解酶序列)才有能力這樣做，這將為精準醫(yī)學提供有價值的生物標志物。此外，闡明微生物失活5-ASA的酶學機制可能有助于未來研發(fā)微生物特異性酶抑制劑，以增強5-ASA的療效。在本研究中，我們的數(shù)據(jù)是觀察性的；需要更多的介入研究來加強我們的發(fā)現(xiàn)，無論是通過在IBD患者中的臨床試驗還是通過單定植小鼠。目前，這些發(fā)現(xiàn)為IBD的個性化微生物醫(yī)學打開了一扇概念之窗。

發(fā)表時間：2024年12月

合作單位：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境保護研究所

發(fā)表期刊：Journal of Hazardous Materials（IF 8.9）

研究背景

塑料污染現(xiàn)狀嚴峻且向納米級轉(zhuǎn)化：塑料已成為現(xiàn)代生活不可或缺的材料，但大量塑料廢棄物造成了全球緊迫的環(huán)境問題，在水、海洋生物、人類排泄物甚至極地沉積物等多種介質(zhì)中均有檢出。環(huán)境風化作用使塑料碎片逐漸分解為微塑料（<5μm）和納米塑料（<1μm），其中納米塑料（NPLs）因更豐富、反應性更強，能到達更偏遠區(qū)域并穿透活細胞，環(huán)境風險遠高于微塑料。納米塑料與抗生素抗性基因（ARGs）的關(guān)聯(lián)研究不足：已有研究表明塑料可促進 ARGs 增殖，且納米材料（如金屬納米顆粒 AgNPs、ZnO NPs）與細菌抗生素抗性進化相關(guān)，但關(guān)于納米塑料對細菌抗生素抗性的影響尚不明確。金屬納米顆粒與納米塑料在物理化學性質(zhì)和界面活性上存在本質(zhì)差異，且雖有研究指出微塑料可吸附 ARGs 加速其傳播，但納米塑料與耐藥菌共存狀態(tài)及作用機制的研究仍較零散。

粘質(zhì)沙雷氏菌的研究價值：粘質(zhì)沙雷氏菌在自然環(huán)境中分布廣泛，可定殖于水和土壤介質(zhì)，是醫(yī)院獲得性感染的重要條件致病菌，能引發(fā)肺炎、尿路感染和敗血癥等疾病，且其自身攜帶 ARGs。隨著廣譜抗生素的大量使用，該菌的耐藥性增強，對臨床治療構(gòu)成挑戰(zhàn)，因此研究納米塑料脅迫下其抗生素抗性軌跡具有重要意義。

測序策略

轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）+基因組測序

研究結(jié)論

1、納米塑料可促進粘質(zhì)沙雷氏菌抗生素抗性進化，且作用受粒徑影響：

暴露于納米塑料后，粘質(zhì)沙雷氏菌對磺胺甲噁唑（SMX）、諾氟沙星（NOR）、鏈霉素（STR）、卡那霉素（KA）等抗生素的抑菌圈逐漸縮小，ARGs 相對豐度顯著高于無納米塑料組（CK），且呈現(xiàn) “200nm 納米塑料組（T2）>600nm 納米塑料組（T1）>CK” 的規(guī)律（T2、T1、CK 的 ARGs 相對豐度中位數(shù)分別為 0.82%、0.62%、0.56%）。

隨著傳代，CK 和 T1 組的 ARGs 豐度呈下降趨勢（歸因于基因適應性成本），但 T1 組下降幅度小于 CK 組，而 T2 組 ARGs 豐度呈上升趨勢，表明小粒徑納米塑料對細菌抗生素抗性進化的促進作用更顯著。

2、不同粒徑納米塑料促進抗性進化的機制存在差異：

600nm 納米塑料：主要通過影響細菌細胞膜通透性促進抗性。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，其誘導的差異表達基因（DEGs）多與物質(zhì)運輸和細胞膜功能相關(guān)，如 LysE 家族轉(zhuǎn)運蛋白、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白通透酶等表達上調(diào)，增強抗生素外排能力，進而提升細菌抗性。

200nm 納米塑料：主要通過調(diào)控細菌代謝過程增強抗性。其誘導的 DEGs 多參與氧化還原過程、羧酸代謝過程等，如硫胺素焦磷酸結(jié)合蛋白（TPP）下調(diào)導致細菌代謝受損，激活抗性相關(guān)基因表達；環(huán)氧奎奴基還原酶 QueH 上調(diào)提高細菌蛋白質(zhì)合成效率，促進外排泵等抗性相關(guān)蛋白合成。同時，200nm 納米塑料對細菌生長抑制更強，使細菌進入低代謝休眠狀態(tài)，抵抗抗生素攻擊。

3、納米塑料通過誘導基因突變增強細菌抗性：

納米塑料暴露會導致粘質(zhì)沙雷氏菌發(fā)生單核苷酸多態(tài)性（SNP）突變，且粒徑越小突變概率越高（T2 組 SNP 純合子數(shù)量 31513 個，T1 組 31380 個）。突變基因功能主要涉及催化活性、結(jié)合、細胞膜、細胞過程和代謝過程，部分突變基因（如 HMI62_RS24365）可改變細胞膜功能，增強抗生素外排，進而提升抗性。

4、納米塑料可加速 ARGs 水平轉(zhuǎn)移，小粒徑作用更突出：

納米塑料暴露顯著提高粘質(zhì)沙雷氏菌的接合轉(zhuǎn)移頻率（T2 組 22.98%、T1 組 8.13%、CK 組 7.35%）和游離質(zhì)粒轉(zhuǎn)化能力（T2 組轉(zhuǎn)化頻率是 CK 組的 6 倍，T1 組是 CK 組的 2 倍），且轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒攜帶多種抗性基因和外排泵基因。

分子對接顯示，納米塑料可與細菌細胞膜蛋白（如 5NUQ，結(jié)合能 – 8.54kcal/mol）結(jié)合，像 “牽引器” 一樣促進細菌間接觸；同時，納米塑料能增強細菌運動能力（T2 組細菌擴散圈最大），進一步提高 ARGs 水平轉(zhuǎn)移頻率。

結(jié)果展示

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2 打開更新結(jié)題報告選項卡：進入?yún)?shù)更改設(shè)置

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