想搭載nanopore三代測(cè)序新技術(shù)科研快車的你，get到研究套路了嗎？ONT重測(cè)序和ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，雙劍合璧！

研究背景

國(guó)際癌癥基因組協(xié)作組(International Cancer Genome Consortium,ICGC)和癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)等已經(jīng)揭示了多種癌癥的致病性突變，其中包括研究較深入的肺腺癌LUAD。超過(guò)一半的LUAD病例具有EGFR和KRAS基因特征性點(diǎn)突變，或者ALK、RET和ROS1的基因融合，并被應(yīng)用于靶向治療策略指導(dǎo)。但，大約20-30％的肺腺癌患者仍未診斷出其癌性突變。

目前的突變研究幾乎都是基于短讀長(zhǎng)的二代測(cè)序平臺(tái)，長(zhǎng)度在200-300bp（目前通用的是PE150bp），比較有利于檢測(cè)點(diǎn)突變（snp和InDel ）。雖然開發(fā)了一系列算法，但短讀長(zhǎng)測(cè)序仍然難以檢測(cè)更復(fù)雜更大的結(jié)構(gòu)變異，如染色體非整倍性、拷貝數(shù)變異CNV和染色體重排。

最近的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)正在改變這種局面，比如單分子實(shí)時(shí)（SMRT）測(cè)序儀PacBio和Nanopore測(cè)序儀，納米孔型測(cè)序儀MinION首次用于表征良性成人家族性肌陣攣性癲癇（BAFME）19號(hào)內(nèi)含子中致病性重復(fù)序列擴(kuò)張，作者以及他人的研究中也通過(guò)Nanopore測(cè)序方法檢測(cè)到了癌癥相關(guān)結(jié)構(gòu)變異，另外Nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序甚至可以一條read可以揭示一個(gè)mRNA的完整剪接模式，并且Nanopore PromethION平臺(tái)通量得到極大提升。

本研究作者試圖用Nanopore測(cè)序技術(shù)研究肺腺癌中存在的之前未解析的致癌性突變。

研究方法

1）作者嘗試使用PromethION平臺(tái)對(duì)整個(gè)人類癌癥基因組進(jìn)行長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序。首先證明PromethION測(cè)序可以相對(duì)容易地識(shí)別點(diǎn)突變以及大的結(jié)構(gòu)畸變和融合基因。并意外地發(fā)現(xiàn)，包含中小型結(jié)構(gòu)變異的復(fù)雜組合突變非常普遍，構(gòu)成了以前未定義的獨(dú)特突變類別，稱為致癌性局部拷貝數(shù)畸變（Cancerous Local Copy-number Lesions
，CLCLs）。

2）隨后，利用長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)Nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)表征全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。

3）最后，結(jié)合之前的其他多組學(xué)數(shù)據(jù)：基于Illumina短reads測(cè)序的全基因組重測(cè)序、RNA-seq和ChIP-seq，證明這些CLCL可能的功能，以及不僅限于細(xì)胞系中，也存在于臨床樣本中。

研究結(jié)果

1、癌細(xì)胞系長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序

使用納米孔測(cè)序儀MinION及其更高通量PromethION平臺(tái)進(jìn)行了長(zhǎng)讀長(zhǎng)全基因組測(cè)序分析。首先通過(guò)對(duì)LC2/ad的基因組進(jìn)行測(cè)序來(lái)驗(yàn)證新型PromethION儀器的性能，LC2/ad是源自日本肺腺癌患者的肺癌細(xì)胞系。作為參考，作者從總共33個(gè)MinION runs（R9.5）中收集了全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，以31×的總測(cè)序深度覆蓋了整個(gè)人類基因組，共有7,282,846條reads（93,813,338,154 base）。reads的*大長(zhǎng)度和N50長(zhǎng)度分別為2,495,160 bp和30,606 bp。采用Minimap2將67.5％的reads比對(duì)到人類參考基因組UCSC hg38。比對(duì)上的reads平均長(zhǎng)度為16,452 bp，總體序列一致性平均為82％，比以前的長(zhǎng)讀長(zhǎng)人類癌癥基因組測(cè)序分析顯著增長(zhǎng)。PromethION測(cè)序需要大約三個(gè)flowcells才能產(chǎn)生總共10,064,668個(gè)reads（100,440,433,160 bp），總覆蓋率為33x，Reads的*大長(zhǎng)度和N50長(zhǎng)度分別為987,834 bp和32,710 bp。使用Minimap2，將69.4％的讀數(shù)定位到參考基因組。比對(duì)上的reads平均長(zhǎng)度為13,620 bp，平均一致性為84.8％。值得注意的是，對(duì)于31X 93G數(shù)據(jù)量，PromethION平臺(tái)不需要制備多個(gè)文庫(kù)33次測(cè)序，因此與MinION相比，PromethION所需的起始DNA總量可減少十倍以上。

PromethION vs MinION：為了探究PromethION測(cè)序是否與MinION測(cè)序兼容，比較了獲得的兩個(gè)數(shù)據(jù)集的特征。Reads長(zhǎng)度的總體分布是相似的（圖1A）。這兩個(gè)數(shù)據(jù)集都包含很大一部分超過(guò)50 kb的長(zhǎng)讀長(zhǎng)reads（MinION：360,786個(gè)讀，PromethION：451,698個(gè)），20X以上測(cè)序深度覆蓋了超過(guò)50％的人類基因組區(qū)域（圖1B），兩個(gè)數(shù)據(jù)集均顯示了超過(guò)80％的整體保真度（圖1C），與先前的研究相似。PromethION平臺(tái)各項(xiàng)指標(biāo)稍微好一點(diǎn)。結(jié)論：PromethION是用于整個(gè)癌癥基因組測(cè)序的有效分析方法。

圖1

在完成對(duì)從MinION和PromethION數(shù)據(jù)的初步評(píng)估后，作者對(duì)另外4個(gè)肺癌細(xì)胞系（A549、REFF-LC-KJ、RELF-LC-MS和PC-14）進(jìn)行了MinION和PromethION測(cè)序，分別覆蓋了9.5-18.5X基因組，例如，在RERF-LC-KJ測(cè)序中，產(chǎn)生了5,986,875個(gè)reads（總堿基數(shù)57,062,227,853 bp，18.5x），Reads*長(zhǎng)長(zhǎng)度和N50長(zhǎng)度分別為922,768 bp和23,442 bp。

補(bǔ)充圖1

為了評(píng)估單堿基水平數(shù)據(jù)質(zhì)量，通過(guò)使用Integrative Genomics Viewer（IGV）手動(dòng)檢查了比對(duì)結(jié)果，針對(duì)相應(yīng)細(xì)胞的已知驅(qū)動(dòng)突變，在A549中，有11條reads顯示出致癌突變KRAS G12S 點(diǎn)突變（左，圖1D）。在PC-14中，8條reads顯示驅(qū)動(dòng)基因NRAS Q61K點(diǎn)突變（右，圖1D）。REFR-LC-KJ和RERF-LC-MS細(xì)胞系中沒(méi)有任何眾所周知的驅(qū)動(dòng)突變。所有這些結(jié)果與以前的報(bào)導(dǎo)一致。這些結(jié)果共同表明，至少當(dāng)癌組織純度（癌細(xì)胞含量）與培養(yǎng)細(xì)胞一樣高時(shí)，僅使用長(zhǎng)讀測(cè)序也可以在單堿基水平上進(jìn)行突變檢測(cè)，即檢測(cè)點(diǎn)突變。
2、大的基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)

使用長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)，嘗試檢測(cè)比點(diǎn)突變大的結(jié)構(gòu)畸變（圖2A）。從LC2/ad的MinION/PromethION數(shù)據(jù)集中，成功鑒定出12條reads與CCDC6-RET融合基因的junction位點(diǎn)直接重疊，這是該細(xì)胞系已知的“癌癥驅(qū)動(dòng)突變”（圖2B)。進(jìn)一步嘗試鑒定大的缺失，前人報(bào)道抑癌基因CDKN2A基因周圍有大的缺失，發(fā)生在LC2/ad，A549和PC-14細(xì)胞中。使用這項(xiàng)研究中的MinION/PromethION數(shù)據(jù)集，我們?cè)俅未_認(rèn)了該基因在各細(xì)胞中的缺失（圖2C）。此外，每個(gè)CDKN2A缺失的√確連接點(diǎn)在細(xì)胞類型之間是不同的。

圖2

通過(guò)采用split比對(duì)方法來(lái)檢測(cè)新的融合基因（圖2A），確定了3種新的重排，通過(guò)Illumina的短讀長(zhǎng)測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了這些重排。LC2/ad中融合基因?yàn)镹ELL1-CCSER1和EFNA5-IKBKB，在RERF-LC-KJ中為UTS2B-GRM4融合基因。每種情況，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序均能以單堿基分辨率√確鑒定連接點(diǎn)。

進(jìn)一步嘗試破譯比較困難的MYC基因重排，確定了LC2/ad中MYC基因的拷貝數(shù)畸變。估計(jì)此擴(kuò)增覆蓋了中心為MYC基因的大約8Mb基因座。即使使用長(zhǎng)讀測(cè)序，仍然很難完全重建其結(jié)構(gòu)，其中包括復(fù)雜的重排模式，在8號(hào)染色體上以估計(jì)的非整倍性為8擴(kuò)展到8 Mb（圖2D）。對(duì)于MYC區(qū)域，嘗試通過(guò)光學(xué)圖譜方法Bionano Saphyr識(shí)別正確的結(jié)構(gòu)。即使使用Saphyr，MYC區(qū)域的√確結(jié)構(gòu)仍然難以捉摸，盡管該分析的結(jié)果支持了跨越8 Mb區(qū)域的MYC擴(kuò)增，具有大約8個(gè)拷貝（圖2E）。
3、鑒定新的致癌結(jié)構(gòu)變異CLCL

在嘗試確定已建立類別的上述結(jié)構(gòu)畸變（CNV、插入INS、缺失DEL、倒位INV、易位ITX/CTX）時(shí)，意外地發(fā)現(xiàn)了一種新型的局部結(jié)構(gòu)變異（圖3）。這些畸變由拷貝數(shù)改變、倒位和缺失的復(fù)雜組合組成，似乎不完全屬于上述類別，因此將其命名為致癌性局部拷貝數(shù)畸變（Cancerous Local Copy-number Lesions，CLCL）。僅基于短讀長(zhǎng)reads很難識(shí)別和表征這些CLCL的√確連接，可能偶爾會(huì)獲得一些提示性信息。

圖3

第一個(gè)例子是在STK11基因座中發(fā)現(xiàn)的。在先前使用Illumina進(jìn)行的肺癌全基因組測(cè)序研究中，發(fā)現(xiàn)RERF-LC-KJ細(xì)胞中STK11基因區(qū)域可能存在局部拷貝數(shù)變異，測(cè)序深度從內(nèi)含子1的中間到基因的末端增加。存在短reads的split標(biāo)簽，這表明該區(qū)域可能發(fā)生反轉(zhuǎn)。盡管在該區(qū)域定位了大量的測(cè)序reads，但仍無(wú)法重建其√確結(jié)構(gòu)。

作者分析了長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)以破譯STK11基因位點(diǎn)的畸變（圖3A）。它揭示了如下畸變：第一次重排是從內(nèi)含子1（chr19：1,216,572；斷點(diǎn)II）開始，到基因下游（chr19：1,228,569；斷點(diǎn)IV）。反向序列繼續(xù)回到內(nèi)含子1的中間（chr19：1,216,360；斷點(diǎn)I，其是起始斷點(diǎn)II上游的212個(gè)堿基），該序列返回并跳至內(nèi)含子3（chr19：1,219,538；斷點(diǎn)III）。后面的序列繼續(xù)到基因座的末端。分別以7條和9條PromethION reads代表檢測(cè)到的junction位點(diǎn)（斷點(diǎn)II/IV和I/III）。當(dāng)我們重新檢查Illumina的reads時(shí)，在斷點(diǎn)I和II之間以及斷點(diǎn)III和IV之間的兩個(gè)區(qū)域（圖3A中的方框區(qū)域），測(cè)序深度都增加了。作者還使用軟切割（soft-clipped）方法分析短讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，使用短讀長(zhǎng)split標(biāo)簽很難檢測(cè)到兩個(gè)斷點(diǎn)I和III，部分原因是junction位點(diǎn)位于重復(fù)區(qū)域。

4、其他癌細(xì)胞系其他基因CLCL突變

為了更普遍地識(shí)別所有肺癌細(xì)胞系其他基因座中的CLCL，作者構(gòu)建了一條新的分析性生物信息學(xué)流程。簡(jiǎn)而言之，利用了來(lái)自比對(duì)結(jié)果的split比對(duì)信息，根據(jù)reads位置對(duì)比對(duì)信息進(jìn)行排序，并提取了候選CLCL。相關(guān)的reads被重組以重建其結(jié)構(gòu)。

在其他細(xì)胞系中也成功鑒定出以下數(shù)量的CLCL：LC2/ad中有16個(gè)，A549中有1個(gè)，RERF-LC-KJ中有7個(gè)，RELF-LC-MS中有7個(gè)，PC-14中有11個(gè)。重要的是，CLCLs甚至出現(xiàn)在關(guān)鍵的癌癥基因中，例如STK11，NF1，SMARCA4和PTEN基因。異常的結(jié)構(gòu)各不相同，并且由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和受累區(qū)域的大小，傳統(tǒng)的基于短讀長(zhǎng)測(cè)序分析的方法不易檢測(cè)到它們中的大多數(shù)。相對(duì)簡(jiǎn)單的一種是在RERF-LC-MS細(xì)胞的NF1基因中檢測(cè)到的（圖3B），內(nèi)含子9（chr17：31,200,948）和最后一個(gè)外顯子36的下游區(qū)域（chr17：31,278,880；在交界處有6條reads支持）之間的串聯(lián)串聯(lián)重復(fù)。在另一種情況下，SMARCA4 CLCL的結(jié)構(gòu)顯示出從內(nèi)含子1（chr19：10,973,314）到內(nèi)含子20（chr19：11,022,573；在交界處有8條reads支持；圖3C）。在PC-14中的PTEN結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了更復(fù)雜的情況，該CLCL是倒位和缺失的組合（圖3D）。在這些相對(duì)簡(jiǎn)單的情況下，將Illumina短reads重新映射到已發(fā)現(xiàn)的junction位點(diǎn)可驗(yàn)證重建結(jié)構(gòu)的√確識(shí)別。

確實(shí)，盡管在先前的研究中部分懷疑了這些突變的存在，但在進(jìn)行這項(xiàng)研究之前，它們的確切結(jié)構(gòu)仍然難以捉摸。作者和其他人以前曾根據(jù)這些case的短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)，懷疑存在大的缺失、移碼缺失和剪接位點(diǎn)突變。然而，通過(guò)基于短讀長(zhǎng)測(cè)序的常規(guī)變異檢測(cè)，無(wú)法檢測(cè)到某些情況，在本研究中，這些情況首先被確定為CLCL（圖3E中黑點(diǎn)）。

作者還檢查了CLCL的基因組背景?？傆?jì)，有64％（28/44）的CLCL具有至少一個(gè)與長(zhǎng)散布核元件（LINE）、短散布核元件（SINE）或長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）重疊的junction位點(diǎn)，分別為13％、24％和4％（12/92、22/92和4/92）（圖3F）。它們的獨(dú)特位置可能會(huì)影響通過(guò)短讀長(zhǎng)測(cè)序?qū)LCL的√確識(shí)別。

5、與CLCL相關(guān)的異常轉(zhuǎn)錄事件

在很多細(xì)胞類型的許多關(guān)鍵基因中發(fā)現(xiàn)了新的CLCL型畸變后，立即提出的問(wèn)題是它們以何種方式產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄或表觀基因組后果。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序-使用MinION重新生成并分析了全長(zhǎng)cDNA測(cè)序數(shù)據(jù)。并利用了以前的Illumina短讀長(zhǎng)RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)。在RERF-LC-KJ細(xì)胞中，短讀長(zhǎng)序列數(shù)據(jù)表明STK11轉(zhuǎn)錄物在內(nèi)含子1處異常剪接，并且轉(zhuǎn)錄躍遷到CLCL結(jié)構(gòu)之前。代表全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的MinION reads進(jìn)一步指明√確的剪接模式和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（圖4A）。對(duì)于幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本，第一次剪接均發(fā)生在異常位置（來(lái)自chr19：1,216,268），并且轉(zhuǎn)錄根據(jù)CLCL結(jié)構(gòu)發(fā)生（RNA-seq reads涵蓋從chr19：1,216,572至chr19：1,228,569的斷點(diǎn)II-IV）。在下游CLCL區(qū)域內(nèi)也觀察到一些異常轉(zhuǎn)錄（中間圖，圖4A）。在STK11基因是野生型的PC-14細(xì)胞中未觀察到這種異常轉(zhuǎn)錄模式（下圖，圖4A）。

圖4

作者檢查了CLCL周圍區(qū)域的表觀基因組標(biāo)記，以H3K4me3，H3K9/14ac和RNA聚合酶II的ChIP-seq表示。不管是否為攜帶CLCL或野生型STK11基因座細(xì)胞系中，染色質(zhì)通常在啟動(dòng)子區(qū)域形成活性結(jié)構(gòu)，并且轉(zhuǎn)錄通常在正確的位置開始（圖4B）。然而，僅在具有CLCL的REFR-LC-KJ細(xì)胞中，H3K36me3標(biāo)記在內(nèi)含子1的中間消失，表明轉(zhuǎn)錄延伸應(yīng)恰好在CLCL開始的地方被破壞。Illumina RNA-seq數(shù)據(jù)還支持RNA在內(nèi)含子1的中間異常剪接，并根據(jù)CLCL結(jié)構(gòu)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。這些異常轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平測(cè)得為2.8 rpkm。沒(méi)有檢測(cè)到正常的轉(zhuǎn)錄本。然而，盡管在某種程度上異常的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)低于野生型，但仍保持了較高的表達(dá)水平。

我們對(duì)其他CLCL進(jìn)行了類似的分析，對(duì)于PC-14中的PTEN基因（圖4C），CLCL位于外顯子6。結(jié)果，該外顯子完全跳躍。因此，所得的轉(zhuǎn)錄本應(yīng)移碼，可能導(dǎo)致PTEN基因的功能喪失。根據(jù)Illumina RNA-seq數(shù)據(jù)檢查了包含CLCL的STK11，NF1，SMARCA4和PTEN基因中的RNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，CLCL通?？赡軐?dǎo)致基因表達(dá)水平降低（圖4D）。但是，在某些情況下，基因表達(dá)水平仍然很顯著，例如RERF-LC-MS細(xì)胞中的NF1轉(zhuǎn)錄本和PC-14細(xì)胞中的PTEN轉(zhuǎn)錄本。

圖4E

為了解決CLCL的生物學(xué)意義，作者研究了受CLCL影響的基因座如何引起蛋白質(zhì)表達(dá)水平及其相關(guān)信號(hào)通路變化。蛋白質(zhì)印跡WB分析發(fā)現(xiàn)STK11，NF1，SMARCA4和PTEN的蛋白質(zhì)在這些基因中帶有CLCL的細(xì)胞中完全丟失了（圖4E）。進(jìn)一步檢查了下游蛋白的激活狀態(tài)，在所有檢查的case中均觀察到了預(yù)期的信號(hào)通路破壞。磷酸化的AKT（phospho-AKT）相應(yīng)地激活mTOR信號(hào)通路，而PTEN抑制AKT的磷酸化。觀察到phospho-AKT異常上調(diào)，反映了PC-14細(xì)胞（PTEN-CLCL）中PTEN的功能喪失。AMPK是在維持細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡中起重要作用的基因，AMPK蛋白在其α亞基處的磷酸化被STK11激活。在RERF-LC-KJ細(xì)胞（STK11-CLCL）中，其激活受到損害。NF1基因是RAS的負(fù)調(diào)控因子，位于RAS信號(hào)通路下游的磷酸化ERK在RERF-LC-MS細(xì)胞（NF1-CLCL）中異常上調(diào)。無(wú)論是由于常規(guī)畸變還是CLCL，相應(yīng)基因的蛋白質(zhì)明顯丟失，但其后果仍會(huì)根據(jù)情況而有所不同。例如，即使STK11蛋白在RERF-LC-MS細(xì)胞（STK11缺失）和RERF-LC-KJ細(xì)胞（STK11-CLCL）中類似地消失，在RERF-LC-KJ細(xì)胞（STK11-CLCL）中磷酸-AMPKα的增強(qiáng)比例也更高。RERF-LC-OK（NF1-缺失）細(xì)胞系中NF1蛋白影響幾乎無(wú)法檢測(cè)到，而對(duì)RERF-LC-MS細(xì)胞（NF1-CLCL）的影響卻很明顯。表明，其他途徑有時(shí)可以彌補(bǔ)關(guān)鍵蛋白的缺失。

6、臨床肺癌標(biāo)本中CLCL突變檢測(cè)

為了檢查臨床肺癌肺腺癌病例中是否也存在CLCL，對(duì)9名日本肺腺癌患者的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行了類似的PromethION全基因組測(cè)序（表3）。表3中顯示了每個(gè)患者所檢測(cè)到的驅(qū)動(dòng)基因突變。平均每個(gè)case生成了43,953,136,203 bp的序列（深度大于10倍）。對(duì)于S10病例，還對(duì)正常組織標(biāo)本進(jìn)行了測(cè)序，以消除可能的正常組織變異和源自比對(duì)錯(cuò)誤的可疑CLCL。

再次成功檢測(cè)到CLCL，9個(gè)樣本中有6個(gè)在其腫瘤基因組中至少包含一個(gè)CLCL，包括幾個(gè)關(guān)鍵的癌癥基因。例如，在病例S8中，確定了RNF20 CLCL。該患者為女性患者，已被證明具有EGFR外顯子19缺失作為驅(qū)動(dòng)突變。但是，其他癌癥突變?nèi)匀浑y以捉摸。RNF20基因的CLCL為內(nèi)含子2（chr9：101,536,324）和內(nèi)含子6（chr9：101,544,752）之間的串聯(lián)重復(fù)，這很可能導(dǎo)致該基因的功能喪失。RNF20基因編碼具有抑癌功能的E3泛素連接酶，并且經(jīng)常發(fā)生突變，特別是在肺癌中。表3總結(jié)了獲得患者致癌作用的分子病因?qū)W指征。需要進(jìn)一步擴(kuò)展長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序序列，以更√確地識(shí)別CLCL的頻率和CLCL偏好的基因。

7、根據(jù)公共短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)重新評(píng)估可能的CLCL

作者嘗試?yán)妙A(yù)先存在的Illumina短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)分析CLCL，希望即使從短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)中也能夠識(shí)別出候選CLCL。并且作者對(duì)先前的短讀長(zhǎng)reads如何展示這些CLCL感興趣。

為了從短讀長(zhǎng)序列識(shí)別CLCL，采用軟切割程序GenomonSV（https://github.com/Genomon-Project/GenomonSV)。選擇“split” reads作為“軟切割”reads，以及成對(duì)末端reads，它們可能跨越SV的junction位點(diǎn)。作為模型數(shù)據(jù)集，首先分析了用于上述PromethION測(cè)序的5種肺癌細(xì)胞系的全基因組短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞系，在基因區(qū)域平均提取182個(gè)“soft-clipped”連接點(diǎn)。將串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)定義為短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)中的假定CLCL。在細(xì)胞系中平均有26個(gè)基因受到推定的CLCL的影響。比較從短讀長(zhǎng)和長(zhǎng)讀長(zhǎng)中檢測(cè)到的CLCL，在PromethION檢測(cè)到的CLCL中，從短讀長(zhǎng)序列數(shù)據(jù)中也檢測(cè)到72％的基因（圖5A）。但是，由于假陽(yáng)性檢出率普遍較高，因此z確率限制為25％。

之后收集并分析了9個(gè)臨床病例約63X測(cè)序深度的全基因組短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)，分析可能的CLCL，確定了可能受推定的CLCLs影響的9個(gè)基因。如圖5B所示，從短讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)開始檢測(cè)到CLCL，估計(jì)靈敏度為73％。但是，由于較短的讀長(zhǎng)reads所固有的各種原因，z確率被限制為14％。

圖5

盡管對(duì)于所有細(xì)胞系和臨床樣品，使用短讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)分別估計(jì)21％和72％的CLCL檢測(cè)z確度和重復(fù)檢出率，但將構(gòu)建的分析流程應(yīng)用于514個(gè) TCGA肺腺癌（TCGA-LUAD）和97個(gè)日本肺腺癌（Japanese LUAD）樣本全外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)分別從TCGA-LUAD和日本LUAD病例中進(jìn)行軟切割reads分析，共檢測(cè)到269個(gè)和50個(gè)具有串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)，這些結(jié)構(gòu)可能對(duì)應(yīng)于CLCL（每個(gè)病例1至29個(gè)基因）?？傆?jì)從155（30％）TCGA-LUAD和39（40％）日本LUAD病例中提取了候選CLCL（圖5C）。

接下來(lái)作者分析了這些病例中是否攜帶299個(gè)與癌癥*相關(guān)的基因CLCL，檢測(cè)到16例（514 + 97例中為2.6％），在17個(gè)癌基因中具有潛在的CLCL（圖5D）。這些病例中有9個(gè)沒(méi)有已知的驅(qū)動(dòng)基因突變。例如，TCGA-49-4512（女性，非吸煙者），在EGFR基因的激酶結(jié)構(gòu)域中鑒定出潛在的CLCL。先前曾報(bào)道過(guò)這種重復(fù)，可能會(huì)導(dǎo)致EGFR異常激活，從而成為該病例的驅(qū)動(dòng)突變，應(yīng)通過(guò)afatinib/阿法替尼等EGFR抑制劑解決該患者的治療目標(biāo)。在另外2個(gè)病例（男性和吸煙）中檢測(cè)到與ERBB2相關(guān)的假定CLCL，似乎在ERBB2基因區(qū)和下游基因間或基因區(qū)之間出現(xiàn)了異常重復(fù)。其他患者在其他重要的抑癌基因（如STK11和PBRM1）中也帶有假定的CLCL，其突變狀態(tài)可用作免疫檢查點(diǎn)抑制劑的假定標(biāo)記物。對(duì)于這些情況，尚不清楚推定的CLCL的√確結(jié)構(gòu)以及功能相關(guān)性，因此，應(yīng)對(duì)它們進(jìn)行詳細(xì)的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序分析。

小結(jié)

本研究中描述了使用PromethION在肺癌基因組中識(shí)別和表征結(jié)構(gòu)畸變，揭示了由局部重復(fù)、倒位和微缺失的復(fù)雜組合組成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)畸變CLCL，進(jìn)一步分析并發(fā)現(xiàn)，即使在關(guān)鍵的癌癥相關(guān)基因中，這些突變也發(fā)生在體內(nèi)，這些突變可能闡明了致癌性事件和治療策略仍然難以捉摸的患者的分子病因。這是將PromethION測(cè)序用于癌癥基因組學(xué)的研究。顯然，需要對(duì)測(cè)序方法本身進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)，并對(duì)計(jì)算方法進(jìn)行改進(jìn)，以達(dá)到進(jìn)一步的目標(biāo)。確實(shí)，這項(xiàng)研究提出的問(wèn)題多于答案。從這個(gè)意義上講，這僅僅是首次研究，為更全面地了解癌癥的復(fù)雜基因組畸變以及進(jìn)一步深入研究其生物學(xué)鋪平了道路。