在三代測(cè)序技術(shù)創(chuàng)新開發(fā)方面，百邁客基于PacBio的Sequel Ⅱ平臺(tái)，通過實(shí)驗(yàn)研發(fā)，在確保有高準(zhǔn)確度和長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，大大提高了數(shù)據(jù)利用率，降低了成本。該產(chǎn)品迄今為止已參與研究近千個(gè)項(xiàng)目，成功開發(fā)近10萬(wàn)份樣本，極大地促進(jìn)了全長(zhǎng)微生物多樣性測(cè)序技術(shù)在微生物組科研領(lǐng)域內(nèi)的普及。
近日，百邁客客戶文章不斷，喜報(bào)頻頻，在恭喜老師論文發(fā)表的同時(shí)，我們對(duì)文章進(jìn)行了解讀，分享給各位讀者，本期分享的為兩篇全長(zhǎng)微生物多樣性在小鼠腸道菌群研究的成功案例，希望能夠?yàn)楦魑焕蠋熖峁┭芯克悸贰?/p>

成功案例一：PacBio全長(zhǎng)微生物多樣性測(cè)序+代謝組學(xué)+細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)

期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety

影響因子：6.291

近日，首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院和環(huán)境毒理學(xué)北京重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在《Ecotoxicology and Environmental Safety》發(fā)表題為“Characterization of gut microbiota, metabolism and cytokines in benzene-induced hematopoietic damage”的研究論文，該論文通過PacBio全長(zhǎng)微生物多樣性測(cè)序，代謝組學(xué)和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)等方法，研究了苯所致造血毒性小鼠腸道菌群、代謝和細(xì)胞因子的關(guān)鍵特征，為闡明苯致造血毒性的可能機(jī)制提供了新的思路。

研究背景

苯是一種普遍存在的環(huán)境和工業(yè)化學(xué)物質(zhì)，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC 1982)列為第一類致癌物, 此前的研究已經(jīng)證實(shí)，苯會(huì)導(dǎo)致各種與血液毒性相關(guān)的不良反應(yīng)，包括全血細(xì)胞減少、骨髓增生異常綜合征、再生障礙性貧血，甚至急性髓系白血病。炎癥可能參與了苯誘導(dǎo)的造血毒性，但腸道菌群、代謝紊亂和炎癥與苯誘導(dǎo)的造血毒性的系統(tǒng)證據(jù)尚未報(bào)道。因此，本研究旨在(1)分析苯暴露30天后小鼠外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)和造血干細(xì)胞的變化;(2)觀察苯暴露30天后小鼠腸道菌群、代謝產(chǎn)物及細(xì)胞因子的變化;(3)探討腸道菌群、代謝特征及細(xì)胞因子與造血損傷的關(guān)系。該研究初步揭示了苯致造血損傷的腸道菌群、代謝和細(xì)胞因子特征，為探討苯致造血損傷的潛在機(jī)制提供了新的思路。

研究方法

試驗(yàn)對(duì)象：

6周齡雄性小鼠24只，隨機(jī)分為4組(每組6只)，每周皮下注射玉米油 (對(duì)照組)或5 mg/kg、25 mg/kg、125 mg/kg油苯混合物

檢測(cè)方法：

盲腸內(nèi)容物16s rRNA基因測(cè)序；

血漿樣本UPLC-MS/MS檢測(cè)；

白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)和血小板(PLT)水平測(cè)定；

相對(duì)臟器重量測(cè)定；

流式細(xì)胞分選；

組織病理學(xué)評(píng)估；

測(cè)序平臺(tái)：

Pacbio sequel II

研究結(jié)果

1.苯暴露后體重和相對(duì)臟器重量的變化

選用有白血病傾向的C57BL/6J小鼠，分別給予苯0.5 mg/kg、25 mg/kg、125 mg/kg劑量處理30天，建立苯致小鼠造血損傷模型。與對(duì)照組相比，暴露于苯的小鼠體重增加較慢，從第三周開始，各組之間有顯著差異。用相對(duì)臟器重量評(píng)價(jià)苯暴露對(duì)小鼠肝、肺、心、腎、脾和胸腺的影響。發(fā)現(xiàn)苯暴露30天后，苯暴露小鼠的肝臟重量增加，并伴隨著胸腺重量的降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)(圖1C和H)。肺、心、腎、脾的相對(duì)臟器重量無(wú)顯著差異(圖1D-G)。

圖1. 暴露30天后苯對(duì)小鼠的總體毒性(每組n=6)。

2.苯暴露對(duì)血液系統(tǒng)的損害

骨髓是苯暴露的主要靶器官，含有大量的造血干細(xì)胞。所有成熟的血細(xì)胞通常來(lái)源于造血干細(xì)胞( HSCs)。暴露于苯的小鼠股骨切片的H&E染色顯示出造血損傷的跡象。苯暴露小鼠骨髓中有核細(xì)胞密度明顯降低，主要表現(xiàn)為髓系造血細(xì)胞(WBC、RBC、巨核細(xì)胞和粒細(xì)胞)減少，細(xì)胞間隙增大，脂肪滴積聚，細(xì)胞腫脹。這些病理改變?cè)?25mg /kg苯組小鼠中更明顯，而在對(duì)照組中則不明顯(圖2A)。為進(jìn)一步研究苯暴露對(duì)造血細(xì)胞生長(zhǎng)和自我更新的影響，采用流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)造血干細(xì)胞LSK、多能祖細(xì)胞(MPPs)、長(zhǎng)期造血干細(xì)胞(LT-HSCs)和短期造血干細(xì)胞（ST- HSCs）。這一結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠相比，接觸苯后LSK和MPPs降低，而 LT-HSCs和ST- HSCs增加(圖2B-E)。苯中毒是惡性腫瘤發(fā)生前的一種表現(xiàn)，其特征是全血細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少。該研究中，125 mg /kg苯組WBC、RBC、HGB和PLT水平顯著降低(P<0.05)(圖2F-I)。綜上所述，LSK比5 mg/kg和25 mg/kg苯暴露組的血液學(xué)變化更敏感，表明LSK可能是對(duì)造血損傷反應(yīng)的敏感指標(biāo)。125 mg/kg苯暴露后，血液系統(tǒng)發(fā)生明顯變化，并形成苯毒性模型。

圖2.苯對(duì)小鼠造血系統(tǒng)的影響

3. 苯暴露小鼠腸道菌群失調(diào)

采集的新鮮盲腸內(nèi)容物進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序分析，結(jié)果表明，各組的Shannon曲線趨于飽和，表明測(cè)序數(shù)據(jù)的數(shù)量和深度足以反映大部分微生物信息(圖3A)。在Venn圖中顯示了四組中共有和特有的OTUs(圖3B)。在本研究中，433個(gè)OTU中有307個(gè)是所有組共有的。接觸苯組和對(duì)照組之間的alpha多樣性并沒有導(dǎo)致微生物群落的差異(圖3C)。值得注意的是，beta多樣性結(jié)果顯示，暴露苯組和對(duì)照組的植物區(qū)系組成和分布有顯著差異(圖3D)。通過LEfSe分析，在暴露于苯的小鼠和對(duì)照小鼠盲腸內(nèi)容物中共鑒定出8個(gè)腸道微生物群，這些差異微生物群的相對(duì)豐度主要反映在屬和種水平上的變化(圖3E-F)。在屬水平，與對(duì)照相比，125 mg/kg苯暴露組中Ruminiclostridium, Desulfovibrio 和 Family_-XIII_AD3011_group，5 mg/kg苯暴露組的Oscil-libacter相對(duì)豐度顯著提高;而GCA-900066225和Candidatus_stoquefichus的豐度則顯著降低(圖4G)。在種水平，25 mg/kg苯暴露組Bacteroides_sartorii的豐度高于對(duì)照組，Anaerotruncus_sp的豐度呈相反的趨勢(shì)(圖4H)。

圖3.苯暴露小鼠盲腸內(nèi)容物腸道菌群分析(每組n=6)

4.苯暴露小鼠的代謝紊亂

使用絕對(duì)定量代謝組學(xué)研究了苯暴露30天后血漿代謝物的差異變化。如圖4A所示，成功建立了PLS-DA模型，相似樣本聚集顯著。同時(shí)，分別用PLS-DA和Mann-Whitney U檢驗(yàn)計(jì)算VIP值和P值。采用UPLC-MS/MS共鑒定了209種血漿代謝物，15種不同代謝物。在VIP>1和P<0.05閾值下，苯暴露小鼠與對(duì)照組之間的潛在生物標(biāo)記物為羥基苯基乳酸)，這些代謝物主要來(lái)自有機(jī)酸、脂肪酸、氨基酸、苯甲酸、肉堿、吲哚和苯丙酸(圖4B和表S2)。15種不同代謝物的劑量效應(yīng)關(guān)系如圖4C所示。

圖4.苯對(duì)小鼠造血系統(tǒng)的影響(每組n=6)
(A)采用偏最小二乘判別分析plot (PLS-DA)實(shí)現(xiàn)樣本類別的預(yù)測(cè)。(B-C)鑒別和定量差異代謝物

5. 苯暴露對(duì)血漿細(xì)胞因子的影響

為了了解細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在苯誘導(dǎo)的造血損傷中的作用，采用Luminex技術(shù)同時(shí)檢測(cè)小鼠血漿中的23種細(xì)胞因子。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，只發(fā)現(xiàn)5 mg/kg組IL-5升高，而在25 mg/kg組中，除IL-5外，Eotaxin也發(fā)生了顯著改變。隨著苯暴露水平的升高，125 mg/kg苯暴露組IL-4、IL-5、IL-10、Eotaxin、MIP-1α和MIP-1β水平顯著升高(表1)。

表一.測(cè)定不同劑量苯暴露組和對(duì)照組23種血漿細(xì)胞因子水平

6.腸道微生物群、代謝產(chǎn)物和細(xì)胞因子與造血損傷的相關(guān)性

為探討不同腸道菌群、不同代謝產(chǎn)物、不同細(xì)胞因子與造血損傷的關(guān)系，研究者采用Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果表明，造血損傷與Ruminiclostridium、Family_XIII_AD3011_group、Bacteroides_sartorii、Anaerotruncus_sp、GCA-900066225和Candidatus_stoquefichus有關(guān)，而與Desulfovibrio和Oscillibacter無(wú)相關(guān)性(圖5A)。篩選得到12種與造血損傷相關(guān)的血漿代謝物，包括2-羥基-2-甲基丁酸、戊二酸、羥丙酸、2,2-二甲基琥珀酸、己二酸、甲基戊二酸、DPA、4-羥脯氨酸、β -丙氨酸、鄰苯二甲酸、棕櫚酰肉堿和羥基苯基乳酸(圖5B)。篩選的差異細(xì)胞因子均與造血損傷相關(guān)，其中IL-5、IL-10和MIP-1α與造血損傷密切相關(guān)(圖5C)。這些結(jié)果表明腸道菌群、代謝和細(xì)胞因子可能參與了苯誘導(dǎo)的造血損傷過程。

圖5.腸道微生物群、代謝產(chǎn)物和細(xì)胞因子與造血損傷的相關(guān)性。
(A) 不同腸道菌群與造血損傷的相關(guān)性。(B)差異代謝物與造血損傷的相關(guān)性。(C)不同細(xì)胞因子與造血損傷的相關(guān)性。* P < 0.05。

前人文獻(xiàn)表明TH2細(xì)胞分泌和產(chǎn)生了上調(diào)的細(xì)胞因子(如IL-4、IL-5和IL-10)，并在機(jī)體中發(fā)揮重要的免疫作用。IL-5在苯暴露組和對(duì)照組表現(xiàn)出顯著的劑量-反應(yīng)關(guān)系，與造血損傷呈極顯著負(fù)相關(guān)。分析表明與IL-5與Family_XIII_AD3011_group呈顯著負(fù)相關(guān)，與Anaerotruncus_sp呈正相關(guān)(圖6A)。此外，羥丙酸和己二酸與IL-5呈負(fù)相關(guān)，而4-羥脯氨酸與IL-5呈正相關(guān)(圖6B)，F(xiàn)amily_XIII_AD3011_group和Anaerotruncus_sp的豐度變化分別與己二酸和4-羥脯氨酸呈顯著負(fù)相關(guān)。綜上所述，F(xiàn)amily_XIII_AD3011_group和Anaerotruncus_sp可能調(diào)節(jié)了已二酸和4-羥脯氨酸的產(chǎn)生水平，這些代謝產(chǎn)物進(jìn)一步激活TH2細(xì)胞大量分泌IL-5，引起促炎反應(yīng)或免疫紊亂(圖6D)。這可能是苯誘導(dǎo)造血毒性的初步潛在機(jī)制，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖6.腸道菌群、代謝產(chǎn)物和細(xì)胞因子與IL-5的相關(guān)性
(A)腸道差異菌群與IL-5的相關(guān)性。(B)差異代謝物與IL-5的相關(guān)性。(C)差異腸道菌群與差異代謝產(chǎn)物的相關(guān)性。(D)在苯誘導(dǎo)的血液毒性中可能涉及腸道微生物群、代謝產(chǎn)物和細(xì)胞因子的信號(hào)通路

研究結(jié)論

苯暴露30天后，小鼠的造血功能受損，在5 mg/kg (1.43 ppm)苯暴露水平下，造血干細(xì)胞優(yōu)先改變于外周血細(xì)胞。在低苯暴露水平下，造血干細(xì)胞的改變可能是一個(gè)更敏感的指標(biāo)。此外，作者系統(tǒng)地分析了苯誘導(dǎo)造血毒性過程中腸道菌群、代謝和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)系，并提出了一些有意義的指標(biāo)，包括2種腸道微生物(Family_XIII_AD3011_group和Anaerotruncus_sp)，2種血漿代謝物(己二酸和4-羥脯氨酸)和促炎細(xì)胞因子IL-5。研究結(jié)果為腸道菌群-代謝-炎癥在苯誘導(dǎo)的造血損傷中的作用提供了新的見解，未來(lái)需要通過功能研究進(jìn)一步探索。

成功案例二：PacBio全長(zhǎng)微生物多樣性測(cè)序+qPCR+功能預(yù)測(cè)

期刊：Food&Function

影響因子：5.396

近日，百邁客與華南生物醫(yī)學(xué)研究中心，福建師范大學(xué)合作，在《Food&Function》發(fā)表題“Kombucha ameliorates LPS-induced sepsis in a mouse model”的研究論文，通過注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥建立小鼠模型，再利用PacBio全長(zhǎng)微生物多樣性測(cè)序，RT-qPCR檢測(cè)，ELISA試劑盒檢測(cè)等方法，研究了康普茶對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠膿毒癥及小鼠腸道微生態(tài)的保護(hù)作用，證實(shí)了康普茶作為一種新型抗炎藥物的潛力。

研究背景

康普茶是一種傳統(tǒng)且流行的發(fā)酵茶飲料，攝入康普茶對(duì)身體有益處。LPS常被用于腹腔注射建立膿毒癥模型，膿毒癥是一種危及生命的疾病，能引起全身炎癥反應(yīng)、免疫紊亂和多器官功能紊亂。康普茶是否能對(duì)膿毒癥有預(yù)防作用？康普茶作用機(jī)制是怎樣？這些問題是本篇文章要核心解決的問題，此次研究的結(jié)果為康普茶在預(yù)防膿毒癥的潛在作用提供了證據(jù)，對(duì)膿毒癥防治具有重要意義。

研究方法

實(shí)驗(yàn)對(duì)象：

特定無(wú)菌C57BL/L的成年小鼠，隨機(jī)分為6組：①Sham（注射磷酸緩沖鹽水，自由喝水），②FD（注射磷酸緩沖鹽水，自由喝康普茶），③IA（注射磷酸緩沖鹽水，康普茶灌胃100 μL/100g，每天），④LPS（注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥，自由喝水），⑤FD+LPS（注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥，自由喝康普茶），⑥IA+LPS（注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥，康普茶灌胃100 μL/100g，每天）。

檢測(cè)方法：

①測(cè)定自制康普茶各項(xiàng)指標(biāo)：還原糖、總多酚、有機(jī)酸、葡萄糖酸等；

②小鼠生理狀況檢測(cè)：監(jiān)控體重、直腸溫度、紅細(xì)胞，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞等生理指標(biāo)，并記錄小鼠死亡率；術(shù)后6h后，收集小鼠血液供下一步分析；

③分子檢測(cè)：肺組織采用RT-qPCR檢測(cè)，ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠血樣炎癥因子，小鼠糞便使用全長(zhǎng)微生物多樣性分析（n=60），蛋白印跡分析。

測(cè)序平臺(tái)：

PacBio Sequel II（百邁客，同時(shí)使用BMK Cloud進(jìn)行生物信息分析）

 

研究結(jié)果

1.康普茶成分、小鼠模型及其生理功效

康普茶含有的成分，且康普茶對(duì)血液系統(tǒng)未造成任何損害。LPS組小鼠體征下降，其他五組小鼠體征相近；LPS組小鼠直腸溫度下降，F(xiàn)D+LPS、IA+LPS組小鼠直腸溫度下降后回升至正常值；康普茶使注射LPS的小鼠存活率上升。

2. 康普茶對(duì)LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的影響

康普茶攝入降低LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠炎癥因子水平、免疫細(xì)胞亞群水平?？灯詹钄z入改變LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠細(xì)胞因子的mRNA水平，肺組織病理學(xué)特征，康普茶攝入顯著降低了LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的肺部組織損傷程度?？灯詹璧臄z入可以抑制LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的NF-κB激活。

圖1.A~F：六組小鼠肺部組織H&E染色顯微鏡圖片，G：六組小鼠肺部損傷的量化評(píng)分

3. 康普茶對(duì)小鼠腸道微生物的影響

①組成分布分析
康普茶攝入對(duì)小鼠腸道微生物門水平分布產(chǎn)生了影響，不同組小鼠的腸道微生物群不同：在Sham組，乳酸桿菌屬為生物標(biāo)志物；在IA組中，彎曲桿菌屬、法克蘭菌屬、瘤胃球菌科和脫硫弧菌屬是生物標(biāo)志物；在FD組中，普雷沃氏菌科屬和未培養(yǎng)的細(xì)菌屬為生物標(biāo)志物。異種桿菌屬是LPS組的生物標(biāo)志物，F(xiàn)D+LPS組是幽門螺桿菌、白桿菌和真桿菌，杜博西菌和念糖菌是IA+LPS組的生物標(biāo)志物。

圖2.六組小鼠腸道微生物組成分布分析

②相關(guān)性分析

計(jì)算6組間差異，評(píng)價(jià)IL-1β、IL-6、TNF-α和HE評(píng)分對(duì)微生物群組合的影響。去鐵桿菌門與IL-6、IL-1β、TNF-α和HE評(píng)分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.852(p<0.001)、0<0.852(p<0.001)、0.843(p<0.001)和0.852(p<0.001)。藍(lán)細(xì)菌門的豐度與IL-6(r=0.523，p<0.05)和TNF-α(r=0.520，p<0.05)呈負(fù)相關(guān)。在屬水平上，幽門螺桿菌與IL-6、IL-1β、TNF-α和HE評(píng)分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.816(p<0.001)、0.776(p<0.001)、0.749(p<0.001)和0.635(p<0.01)。12B)。蛛網(wǎng)膜梭狀芽孢桿菌與IL-1β、IL-6和TNF-α也呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.700(p<0.01)、0.515(p<0.05)和0.509(p<0.05)。而腐爛別樣桿菌與IL-6和TNF-α呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.482(p<0.05)和0.517(p<0.05)。

圖3.六組小鼠腸道微生物熱圖分析（A.門水平，B.屬水平）

③PICRUSt分析

預(yù)測(cè)IA和IA+LPS組的功能基因，1343條顯著差異通路，其中“全局和概述”、“碳水化合物代謝”、“氨基酸代謝”、“能量代謝”、“輔助因子和維生素代謝”、“膜運(yùn)輸”、“核苷酸代謝”、“翻譯”、“復(fù)制修復(fù)”、“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”的平均比例高，且都是顯著代謝途徑（p<0.05）。

圖4.PICRUSt功能預(yù)測(cè)分析

研究結(jié)論

康普茶可有效預(yù)防膿毒癥初期小鼠的細(xì)胞免疫功能紊亂，并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。此外，補(bǔ)充康普茶改變了腸道微生物群的多樣性，促進(jìn)了丁酸鹽產(chǎn)生細(xì)菌的生長(zhǎng)，發(fā)揮抗炎作用。

總結(jié)

通過以上兩篇文章，我們可以發(fā)現(xiàn)，通過腸道菌群全長(zhǎng)微生物多樣性測(cè)序+生理生化指標(biāo)測(cè)定+細(xì)胞因子檢測(cè)+代謝組學(xué)檢測(cè)等能夠較為全面的闡明生物學(xué)問題。通過對(duì)多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析進(jìn)而可以得到菌群與細(xì)胞因子，菌群與代謝物之間的相關(guān)性，同時(shí)運(yùn)用PacBio全長(zhǎng)微生物多樣性能夠在種水平上尋找差異的物種，進(jìn)一步提升biomarker的鑒定水平。正值年末，百邁客微生物系列產(chǎn)品促銷活動(dòng)火熱進(jìn)行中，無(wú)論是測(cè)序還是分析，價(jià)格優(yōu)惠，歡迎垂詢~

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參考文獻(xiàn)：

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