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英文名稱：N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg efect: implication in colorectal cancer

中文名稱：N6-甲基腺苷（m6A）閱讀蛋白IMP2能穩(wěn)定ZFAS1/OLA1軸并激活沃伯格效應(yīng)：在結(jié)直腸癌中的意義

雜志名稱：J Hematol Oncol.

影響因子：17.233

摘要

背景：越來越多的證據(jù)表明N6-甲基腺嘌呤（m6A）調(diào)節(jié)因子有助于結(jié)直腸癌（CRC）的病因?qū)W和進(jìn)展研究。然而，參與糖酵解代謝的m6A閱讀蛋白的確切機(jī)制仍然模糊不清。本文旨在將m6A閱讀蛋白與糖代謝串聯(lián)起來，揭示一種CRC進(jìn)展的新機(jī)制。

方法：通過生物信息學(xué)、ISH和IHC檢測，分析了候選lncRNA和m6A閱讀蛋白之間的關(guān)系。利用體內(nèi)和體外研究（包括MTT、CFA、反式孔、細(xì)胞凋亡、免疫印跡、qRT-PCR和異種移植小鼠模型）來探討這些指標(biāo)的生物學(xué)功能。利用乳酸檢測、ATP活性檢測和ECAR檢測驗(yàn)證其下游靶點(diǎn)的生物學(xué)功能。利用生物信息學(xué)、RNA穩(wěn)定性、RIP實(shí)驗(yàn)和RNA下拉實(shí)驗(yàn)探索其潛在的分子機(jī)制。

結(jié)果：本文發(fā)現(xiàn)在CRC增殖和進(jìn)展過程中，m6A閱讀蛋白IMP2與長鏈非編碼RNA（lncRNA）ZFAS1以依賴m6A調(diào)節(jié)的方式進(jìn)行串聯(lián)，隨后增強(qiáng)了OBG-樣ATPsae1（OLA1）和腺嘌呤三磷酸（ATP）水解和糖酵解的募集。

材料方法

實(shí)驗(yàn)樣本：144對(duì)CRC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織；CRC細(xì)胞系和正常人腸道上皮細(xì)胞系

實(shí)驗(yàn)方法：lncRNA-mRNA芯片測序，qPCR，WB蛋白印跡分析，組織微陣列（TMA）和免疫組化（IHC），lncRNA ISH檢測，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)（CFA），細(xì)胞凋亡檢測，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IF），m6A斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，RNA穩(wěn)定性測定， RNA下拉實(shí)驗(yàn) ，RIP-PCR檢測，ATP含量檢測，LD含量檢測，ATP酶活性檢測，細(xì)胞外酸化速率測定（能發(fā)高分文章的秘訣）。

結(jié)果

1、CRC細(xì)胞和組織中l(wèi)ncRNA的失調(diào)與IMP1/2/3的表達(dá)相關(guān)

在CRC組織中，只有IMP2表達(dá)量比較高，且遠(yuǎn)高于IMP1和IMP3（圖1b）。同樣發(fā)現(xiàn)IMP2在7個(gè)CRC細(xì)胞系（(LOVO，CACO2，SW48，SW480，HT29，HCT116和 SW620)中的表達(dá)量也高于結(jié)直腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)量（圖1c）。而m6A斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果表明，總m6A在CRC細(xì)胞系（特別是HCT116、SW620和HT29細(xì)胞系）中的水平要高于正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞（圖1d）。這和之前對(duì)IMP2的功能研究結(jié)論一致，即穩(wěn)定RNA的表達(dá)，增加總RNA的m6A水平。

然后分析了m6A閱讀蛋白IMP1/2/3的RNA免疫沉淀測序（RIP-seq)數(shù)據(jù)以及TCGA中的數(shù)據(jù)，獲得了7個(gè)候選的lncRNA。其中ZFAS1、SNHG15和CRNDE表現(xiàn)出明顯的高表達(dá)（圖1e）。在CRC細(xì)胞中，ZFAS1表現(xiàn)出最明顯的高表達(dá)（圖1f）。在IMP1/2/3和ZFAS1之間計(jì)算相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ZFAS1和IMP2之間存在明顯的正相關(guān)（圖1g）。

為了研究IMP2在ZFAS1表達(dá)中的潛在作用及其相關(guān)的m6A甲基化水平，本文進(jìn)行了組織微陣列（TMA）、RNA原位雜交（ISH）和免疫組化（IHC）檢測，分析CRC組織樣本和對(duì)應(yīng)的癌旁組織（n=144）中IMP、m6A和ZFAS1的表達(dá)（圖1h）。值得注意的是，在CRC組織中，IMP2、ZFAS1的表達(dá)和m6A的甲基化水平急劇增加（圖1i）。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)模式分析，表明IMP2和ZFAS1的表達(dá)和m6A水平呈現(xiàn)正相關(guān)性（圖1j）。

為了進(jìn)一步探討這些指標(biāo)在隊(duì)列中作為獨(dú)立預(yù)后因素的臨床效用，對(duì)144例CRC組織和癌旁組織進(jìn)行了秩和檢驗(yàn)和多變量cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)IMP2表達(dá)量的升高顯著縮短了總生存期（OS）和無病生存期（DFS），m6A甲基化的高表達(dá)與不良的OS和DFA顯著相關(guān)，而ZFAS1表達(dá)量高的CRC患者的OS急劇下降。DFS也明顯下降（圖1k）。說明IMP2、m6A和ZFAS1的表達(dá)與CRC患者的生存狀況有著明顯的相關(guān)性。

總之，這些結(jié)果表明IMP2在CRC細(xì)胞和組織中高表達(dá)，并伴隨著相關(guān)的m6A甲基化水平和ZFAS1的表達(dá)。這些指標(biāo)也表示了其作為獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測因子的潛在功能，可用于未來的CRC評(píng)估和治療的生物標(biāo)志物。

圖1（上下滑動(dòng)查看）

2、CRC細(xì)胞中IMP2通過直接與ZFAS1的m6A位點(diǎn)結(jié)合促進(jìn)ZFAS1的穩(wěn)定性

為了探索在CRC腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，IMP2介導(dǎo)的m6A甲基化穩(wěn)定性及其相關(guān)的ZFAS1表達(dá)的關(guān)鍵生物學(xué)特征，在HCT116和SW620細(xì)胞系中檢測干擾IMP2后的IMP2和ZFAS1的表達(dá)。結(jié)果表明異位IMP2的表達(dá)明顯地增強(qiáng)了ZFAS1和IMP2的表達(dá)。然而通過qPCR定量分析發(fā)現(xiàn)IMP2的敲除抑制了HCT116和SW620中ZFAS1和IMP2的表達(dá)（圖2b）。在IMP2敲除的CRC細(xì)胞中，通過上調(diào)ZFAS1的表達(dá)來進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn)，通過qPCR發(fā)現(xiàn)ZFAS1的表達(dá)的確得到了恢復(fù)（圖2c）。更重要的是，RNA穩(wěn)定性分析進(jìn)一步確定了與空載體處理的細(xì)胞相比，IMP2敲除或在不同時(shí)間點(diǎn)(0,2,4,6 h)進(jìn)行放線菌素D治療的HCT116和SW620 細(xì)胞中ZFAS1 RNA的半衰期是減少的（圖2d）。這些發(fā)現(xiàn)說明IMP2作為一個(gè)m6A閱讀蛋白對(duì)ZFAS1有穩(wěn)定作用。

為了驗(yàn)證IMP2和ZFAS1之間的直接關(guān)聯(lián)，初步分析了FLAG標(biāo)記的IMP1/2/3的RIP-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)和對(duì)照相比，異位IMP2的表達(dá)極大地豐富了HEK293T細(xì)胞的內(nèi)源性ZFAS1（圖2e)。此外，RNA結(jié)合蛋白的數(shù)據(jù)說明IMP2蛋白有一個(gè)特定的結(jié)合域可以識(shí)別ZFAS1中的m6A motif（圖2f）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證IMP2和ZFAS1結(jié)合位點(diǎn)的可靠性，進(jìn)行了共定位的ISH和免疫熒光（IF）檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZFAS1和IMP2的表達(dá)分布相一致，主要結(jié)合位點(diǎn)在HCT116和SW620的細(xì)胞質(zhì)中，部分在細(xì)胞核中（圖2j）。RIP分析發(fā)現(xiàn)相比對(duì)照組，用m6A抗體富集得到了更高表達(dá)的ZFAS1（圖2k），RNA下拉實(shí)驗(yàn)說明了通過攜帶m6A motif與IMP2蛋白特定結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合（圖2m）。利用qPCR驗(yàn)證IMP2 KH3-4的WT和Mut載體處理后的HEK293T細(xì)胞中ZFAS1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)量顯著減少（圖2i），說明IMP2 KH3-4結(jié)構(gòu)域可以與ZFAS1直接相互作用。

以上數(shù)據(jù)結(jié)果說明IMP2通過KH3-4直接與ZFAS1上的m6A位點(diǎn)結(jié)合，并增強(qiáng)了ZFAS1的穩(wěn)定性（圖2a）。

 

圖2（上下滑動(dòng)查看）

3、IMP2通過調(diào)節(jié)ZFAS1在CRC細(xì)胞中的表達(dá)來調(diào)控生物學(xué)特性

為了進(jìn)一步明確在CRC細(xì)胞中IMP2和ZFAS1特異性的調(diào)控模式，首先通過MTT實(shí)驗(yàn)（圖3b）和細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)（CFA）（圖3c）分析了干擾IMP2表達(dá)后的HCT116和SW620細(xì)胞系的細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞克隆能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)異位IMP2的表達(dá)顯著促進(jìn)了CRC細(xì)胞的生長和克隆能力，而IMP2的耗竭抑制了CRC細(xì)胞的增殖。此外還檢測了細(xì)胞侵襲能力（圖3d），發(fā)現(xiàn)在沉默IMP2時(shí)，細(xì)胞的遷移受到了明顯的抑制，而IMP2的過表達(dá)極大地提高了HCT116和SW620細(xì)胞系的侵襲能力。還發(fā)現(xiàn)IMP2的敲除增加了CRC細(xì)胞的凋亡率，IMP2的過表達(dá)會(huì)抑制CRC細(xì)胞的凋亡率（圖3e）。后續(xù)通過拯救實(shí)驗(yàn)表明ZFAS1的過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了對(duì)CRC細(xì)胞的促進(jìn)作用，包括細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞克隆能力、細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞凋亡率（圖3f-i）。
這些結(jié)果說明IMP2通過促進(jìn)ZFAS1的穩(wěn)定性和表達(dá)來增加CRC細(xì)胞的增殖，抑制CRC細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，而IMP2對(duì)細(xì)胞表型的影響可以通過調(diào)節(jié)ZFAS1的表達(dá)來恢復(fù)。

圖3（上下滑動(dòng)查看）

 

4、在CRC細(xì)胞中鑒定到OLA1是IMP2穩(wěn)定的的ZFAS1的關(guān)鍵靶點(diǎn)

為了進(jìn)一步挖掘影響CRC細(xì)胞表型和功能的ZFAS1的下游靶點(diǎn)，在CRC細(xì)胞中進(jìn)行了相關(guān)的功能研究。首先通過熱圖分析發(fā)現(xiàn)了與ZFAS1過表達(dá)正相關(guān)的潛在下游靶點(diǎn)，并通過公開數(shù)據(jù)集進(jìn)行驗(yàn)證（圖4a，b)。交集結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了線粒體能量代謝相關(guān)基因OLA1，進(jìn)一步通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)與對(duì)照細(xì)胞相比，OLA1在7個(gè)CRC細(xì)胞系中顯著過表達(dá)（圖4c）。同樣在CRC組織和癌旁組織的qPCR結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，OLA1的表達(dá)在CRC組織中更高（圖4d）。結(jié)果說明OLA1在CRC的組織和細(xì)胞樣本中都是高表達(dá)的，且OLA1和ZFAS1的表達(dá)模式高度一致。

隨后采用TMA和IHC檢測OLA1的表達(dá)（圖4e），通過RCO曲線評(píng)估OLA1的低/高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，CRC組織中觀察到明顯的OLA1表達(dá)，表現(xiàn)出致癌基因的特性（圖4e，f）。且OLA1與ZFAS1的表達(dá)存在正相關(guān)性（圖4g）。與臨床數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析，結(jié)果表明OLA1低表達(dá)的患者占比較高（圖4h），OLA1高表達(dá)的CRC患者的DFS和OS時(shí)間明顯縮短了（圖4i）。后續(xù)針對(duì)OLA1是否是ZFAS1的下游靶點(diǎn)做驗(yàn)證，IMP2沉默/過表達(dá)不僅降低/增加了OLA1 mRNA的表達(dá)，而且降低/增加了OLA1蛋白的表達(dá)。但是IMP2對(duì)OLA1的影響可以被ZFAS2完全逆轉(zhuǎn)（圖4j-l）。

這些發(fā)現(xiàn)表明在CRC細(xì)胞和組織中，OLA1受到被m6A修飾和m6A穩(wěn)定的ZFAS1表達(dá)的正向調(diào)控，進(jìn)一步的預(yù)后評(píng)估揭示OLA1可以成為預(yù)測CRC臨床結(jié)果的一個(gè)潛在生物標(biāo)志物。

 

圖4（上下滑動(dòng)查看）

 

5、ZFAS1通過與OLA1的OBG型功能域結(jié)合增強(qiáng)OLA1的活性并激活糖酵解代謝

接下來通過ISH和IF實(shí)驗(yàn)證明ZFAS1和OLA1在CRC細(xì)胞中的共定位。結(jié)果表明，OLA1和ZFAS1不僅持續(xù)分布在HCT116和SW620細(xì)胞系的細(xì)胞質(zhì)中，而且還分布在細(xì)胞核中（圖5b）。為了確定ZFAS1是否與OLA1有直接的結(jié)合位點(diǎn)，并研究ZFAS1中關(guān)鍵的m6A位點(diǎn)對(duì)OLA1的影響，本研究將ZFAS1的三個(gè)A堿基替換成U堿基，并重新預(yù)測了
ZFAS1的三級(jí)結(jié)構(gòu)。有趣的是，ZFAS1-WT和ZFAS1-Mut都是與OLA1的OBG型功能域結(jié)合，而且ZFAS1-WT和OLA1的結(jié)合強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ZFAS1-Mut和OLA1的結(jié)合強(qiáng)度（圖5c）。RNA下拉實(shí)驗(yàn)表明，ZFAS1-WT的探針能顯著下拉OLA1，而當(dāng)ZFAS1的m6A位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，ZFAS1-WT不能再下來OLA1（圖5d）。所有結(jié)果說明OLA1蛋白特異性結(jié)構(gòu)域能和含有ZFAS1-OLA1結(jié)合motif之間有直接結(jié)合作用。此外，OLA1表達(dá)的減少導(dǎo)致其ATP酶活性的降低，而ZFAS1的過度表達(dá)可以恢復(fù)OLA1的ATP酶活性。但是當(dāng)ZFAS1的關(guān)鍵m6A位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，ZFAS1對(duì)OLA1的ATP酶活性的恢復(fù)作用也消失了（圖5e）。這也證明了ZFAS1對(duì)OLA1的ATP酶活性的促進(jìn)作用取決于ZFAS1和OLA1的結(jié)合。

接下來探索OLA1的ATP酶活性的變化對(duì)CRC細(xì)胞能量代謝的影響，研究了HCT116和SW620細(xì)胞系中乳酸和ATP的含量。發(fā)現(xiàn)OLA1表達(dá)的減少不僅可以降低乳酸的積累，還可以減少細(xì)胞中ATP的含量（圖5f，g）。通過細(xì)胞外酸化率的測定檢測OLA1的變化對(duì)CRC細(xì)胞的糖酵解代謝能力的影響，發(fā)現(xiàn)OLA1表達(dá)的減少可以顯著降低CRC細(xì)胞的糖酵解代謝能力，ZFAS1-WT可以恢復(fù)OLA1表達(dá)減少對(duì)CRC細(xì)胞糖酵解代謝能力的影響（圖5h）。

總之，ZFAS1可以直接與OLA1的OBG型功能域結(jié)合，從而增強(qiáng)OLA1的ATP水解能力，促進(jìn)乳酸的積累，激活了CRC細(xì)胞的糖酵解途徑，最終促進(jìn)CRC能量的釋放（圖5a）。

圖5（上下滑動(dòng)查看）

 

6、IMP2-ZFAS1-OLA1信號(hào)軸影響到線粒體能量代謝

通過電子顯微鏡觀察到IMP2沉默后線粒體形態(tài)發(fā)生變化，即發(fā)現(xiàn)CRC細(xì)胞中線粒體明顯腫脹和受損，IMP2沉默后線粒體的形態(tài)回復(fù)正常（圖6b）。同時(shí)IMP2的過度表達(dá)促進(jìn)了HK2（糖酵解的關(guān)鍵蛋白）的表達(dá)，抑制了PDHA1（氧化磷酸化的關(guān)鍵蛋白）的表達(dá)（圖6c）。然而ZFAS1沉默/過度表達(dá)和IMP2過表達(dá)/沉默后，HK2和PDHA1的表達(dá)水平得到恢復(fù)（圖6d）。

IMP2的過度表達(dá)明顯增強(qiáng)了乳酸和ATP的釋放，還發(fā)現(xiàn)IMP2敲除導(dǎo)致乳酸和ATP含量的釋放大幅度減少，而ZFAS1可以完全逆轉(zhuǎn)IMP2的影響（圖6e，f）。細(xì)胞能量代謝檢測進(jìn)一步表明IMP2沉默減弱了細(xì)胞的糖酵解代謝能力，而ZFAS1可以逆轉(zhuǎn)IMP2沉默對(duì)糖酵解水平降低的影響（圖6g，h）。

總而言之，這些發(fā)現(xiàn)表明IMP2以依賴m6A的方式穩(wěn)定ZFAS1的表達(dá)，與OLA1介導(dǎo)的線粒體能量代謝有著重要的聯(lián)系。

圖6（上下滑動(dòng)查看）

 

7、IMP2在體內(nèi)通過穩(wěn)定ZFAS1促進(jìn)細(xì)胞增殖

利用異體移植模型驗(yàn)證IMP2-ZFAS1-OLA1信號(hào)軸在體內(nèi)的生物學(xué)功能（圖7a），預(yù)后評(píng)估顯示異種移植小鼠在與shIMP2和ZFAS1載體共同轉(zhuǎn)染后，生存時(shí)間明顯縮短（圖7b），表明IMP2和ZFAS1在CRC預(yù)后評(píng)估中具有協(xié)同作用。此外，轉(zhuǎn)染shIMP2載體的異種移植小鼠中，腫瘤體積、大小和重量都明顯減少；然而，在與shIMP2和ZFAS1載體共同轉(zhuǎn)染后，腫瘤體積、大小和重量急劇增加（圖7c-e）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在異種移植模型中，ZFAS1的過表達(dá)明顯地逆轉(zhuǎn)了IMP2沉默對(duì)腫瘤生長的抑制作用（圖7f）。

總之，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，通過利用m6A誘導(dǎo)的穩(wěn)定性的IMP2與ZFAS1/OLA1軸的相互作用，IMP2敲除抑制了異種移植模型的腫瘤生長和惡化。

圖7（上下滑動(dòng)查看）

結(jié)論

本文揭示了IMP2-ZFAS1-OLA1信號(hào)軸在CRC腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的新調(diào)節(jié)機(jī)制。在CRC細(xì)胞中，IMP2正向調(diào)節(jié)lncRNA ZFAS1。異位IMP1增強(qiáng)了ZFAS1的穩(wěn)定性和表達(dá)，而敲除IMP2會(huì)抑制ZFAS1的表達(dá)?；赗NA識(shí)別的motif，IMP2蛋白的KH3-4結(jié)構(gòu)域在功能上被認(rèn)為是直接與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)了ZFAS1中+843 m6A位點(diǎn)的RNA識(shí)別。此外，ZFAS1直接與OLA1結(jié)合，增強(qiáng)了OLA1的ATP酶活性，介導(dǎo)了線粒體的能量代謝，包括ATP水解和糖酵解代謝的生物過程，并最終影響到CRC細(xì)胞命運(yùn)?？偟膩碚f，本文在結(jié)直腸癌預(yù)防和治療中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的信號(hào)軸，即識(shí)別到新的靶點(diǎn)和將m6A表觀遺傳修飾與線粒體能量轉(zhuǎn)換串聯(lián)起來。

圖8（上下滑動(dòng)查看）

 

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參考文章：

Lu S, Han L, Hu X, et al. N6-methyladenosine reader IMP2 stabilizes the ZFAS1/OLA1 axis and activates the Warburg effect: implication in colorectal cancer. J Hematol Oncol. 2021;14(1):188. Published 2021 Nov 7. doi:10.1186/s13045-021-01204-0