研究背景

下丘腦在調(diào)節(jié)機(jī)體基本穩(wěn)態(tài)和行為方面具有關(guān)鍵作用，包括進(jìn)食、日常節(jié)律、繁殖、壓力反應(yīng)等。下丘腦神經(jīng)元多樣化的特點(diǎn)是經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)（氨基丁酸?[GABA]、谷氨酸、乙酰膽堿、多巴胺或組胺）和不同神經(jīng)肽或激素的聯(lián)合表達(dá)，這是構(gòu)成下丘腦功能復(fù)雜性的基本因素。神經(jīng)元亞群的發(fā)育異常會(huì)誘發(fā)下丘腦功能障礙相關(guān)疾病，如肥胖、能量失衡和睡眠障礙。對(duì)嚙齒動(dòng)物的研究揭示了胎兒和成人下丘腦在細(xì)胞和分子水平上的特性，并提供了對(duì)下丘腦復(fù)雜細(xì)胞層次和功能的詳細(xì)了解。然而，關(guān)于人類下丘腦膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元發(fā)育的時(shí)空分子特征知之甚少。

研究材料

材料：人類下丘腦的采樣時(shí)間范圍從妊娠周（GW）7到20（具體為GW7、GW8、GW10、GW12、GW15、GW18、GW20），其中GW12和GW18分別兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)；GW15到GW20（GW15、GW18_1、GW20），沿前后軸大致分為三組，大致對(duì)應(yīng)于前、結(jié)節(jié)/內(nèi)側(cè)和后域

方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序、免疫熒光

研究成果

1、人類下丘腦發(fā)育的分子多樣性

本研究利用scRNA-seq檢測了112,376個(gè)人類下丘腦細(xì)胞，分別為GW7-20（圖?1A）。聚類分析確定了主要細(xì)胞群（圖?1B），通過marker基因來鑒定已知細(xì)胞類型，包括神經(jīng)上皮細(xì)胞（NE）、NP、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、OL前體細(xì)胞（OPC）、OL譜系細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等（圖?1C，1D）?；诩?xì)胞類型和分子功能，將下丘腦發(fā)育的進(jìn)程分為四個(gè)階段：GW7、GW8-10、GW12-15和GW18-20（圖?1E，1F）。通過免疫熒光也觀察到GW15下丘腦后部區(qū)域的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞比例低于前部/內(nèi)側(cè)區(qū)域（圖?1G，1H），表明膠質(zhì)細(xì)胞的在不同空間區(qū)域的發(fā)育是不同步的。

2、早期下丘腦NE和祖細(xì)胞的異質(zhì)性

根據(jù)細(xì)胞群間的差異基因確定細(xì)胞類型，包括NE、NP、神經(jīng)元和一些間充質(zhì)腦膜樣成纖維細(xì)胞（圖?2A）。免疫染色顯示了GW8中不同類型細(xì)胞的基因表達(dá)和位置（圖?2B，2C），同時(shí)發(fā)現(xiàn)LUM、COL3A1和FOXC1在腦膜細(xì)胞中高度表達(dá)（圖?2D）。排除腦膜樣成纖維細(xì)胞簇，構(gòu)建了GW7其余細(xì)胞的發(fā)育軌跡（19,916?個(gè)細(xì)胞；圖?2E），發(fā)現(xiàn)從NE到NP的細(xì)胞發(fā)育譜系，通過對(duì)DEG的GO分析，確定了從NE到早期祖細(xì)胞（圖?2F）譜系轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵信號(hào)通路。此外，還展示了從NE到NP關(guān)鍵TF的表達(dá)模式（圖?2G）。通過亞群分析，確定了7個(gè)NE亞型和8個(gè)NP亞型（圖?2H）。此外，評(píng)估了早期NE和NP亞群之間的潛在關(guān)系（圖?2I，2H）。這些結(jié)果表明，不同下丘腦位置的早期NPs顯示出分子異質(zhì)性。

3、由調(diào)節(jié)基因控制的不同祖細(xì)胞分化命運(yùn)

NP被進(jìn)一步細(xì)分為25種細(xì)胞類型（圖?3A），使用SCENIC算法進(jìn)行了“調(diào)節(jié)子”分析，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞譜系富含參與神經(jīng)膠質(zhì)的多個(gè)已知調(diào)節(jié)子，包括OLIG1/2、SOX8和幾個(gè)早期基因相關(guān)的調(diào)節(jié)子（圖?3B，3C）以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。基于基因網(wǎng)絡(luò)和富集分析（圖?3D，3E），發(fā)現(xiàn)在結(jié)節(jié)NP亞型中表達(dá)的OTP和PRDM12調(diào)節(jié)子可以調(diào)節(jié)不同的ARC神經(jīng)元命運(yùn)，這與它們?cè)诳刂艫RC分化中的作用一致。這些數(shù)據(jù)表明，NPs的細(xì)胞命運(yùn)確定發(fā)生在下丘腦發(fā)育的早期階段，并且細(xì)胞分化由多個(gè)關(guān)鍵TF的組合決定。

4、下丘腦神經(jīng)元的時(shí)空組成

將神經(jīng)元（n=32,811個(gè)細(xì)胞）細(xì)分為50個(gè)簇，包括GABA能、谷氨酸能和組胺能（HDC）神經(jīng)元（圖?4A）。幾種亞型的空間特征由其特定神經(jīng)肽的表達(dá)明確定義（圖?4B）。通過對(duì)幾個(gè)代表性核的相關(guān)分布研究，發(fā)現(xiàn)前/結(jié)節(jié)區(qū)域的核生成出現(xiàn)在早期（GW7-8），而后部區(qū)域的核生成發(fā)生在GW10之后（圖?4C）。表明人類下丘腦中的不同細(xì)胞核是在不同的時(shí)間窗中形成的，遵循前后和內(nèi)外空間排序。

5、ARC神經(jīng)元亞群的不同譜系軌跡

本研究共收集3,628個(gè)ARC，確定了六種ARC亞型，包括KISS1+TAC3+、GHRH+GSX1+、SST+PCP4+、AGRP+NPY+、POMC+CBLN1+和POMC+TBX3+簇（圖?4B）。通過整合和預(yù)測分析確定了有助于ARC形成的NP，從NP1、NP2和NP17中提取了與ARC相關(guān)的祖細(xì)胞，并在ARC中繪制了這些祖細(xì)胞和神經(jīng)元亞型，以使用velocyto進(jìn)行擬時(shí)序分析（圖?4D），發(fā)現(xiàn)人類ARC中的神經(jīng)元亞群在轉(zhuǎn)錄上出現(xiàn)在不同的時(shí)間點(diǎn)（圖?4E）。利用免疫染色來驗(yàn)證神經(jīng)元亞型marker的表達(dá)，觀察到POMC表達(dá)，并且KISS1+細(xì)胞顯著存在于外側(cè)ARC中，但在GW17僅觀察到少數(shù)表達(dá)NPY的細(xì)胞（圖?4F）。這些結(jié)果揭示了ARC神經(jīng)元亞群的分子多樣性，并且它們發(fā)育的時(shí)間不同。

6、OL的分子表達(dá)異質(zhì)性

本研究確定了EGFR+?pre-OPC、PDGFRA+?OPC（OPCs）和OL（BCAS1+?和?MBP+）（圖?5A），然后將OPC分為四個(gè)亞型，OL分為六個(gè)亞型（圖?5B）。使用velocyto對(duì)OPC和未成熟OL亞群進(jìn)行軌跡分析，確定了人類下丘腦OL譜系的不同分化路徑（圖?5C）。根據(jù)不同妊娠期OL譜系亞群的比例，發(fā)現(xiàn)從OPC2到OL1和從OPC1到OL2的兩條OL早期路徑分別代表GW12和GW18/20的峰值（圖?5D）。對(duì)人類下丘腦中的PDGFRA、MBP和OLIG2進(jìn)行免疫染色，發(fā)現(xiàn)PDGFRA+?OPCs少量存在于GW10地幔區(qū)，并從GW12到GW17逐漸增加（圖?5E）。對(duì)EGFR、PDGFRA和MBP進(jìn)行了免疫染色，分別在三個(gè)時(shí)間階段（GW12、GW14、GW17）的前部、內(nèi)側(cè)和后部區(qū)域顯示preOPCs、OPCs和OLs特征。這些OL譜系細(xì)胞在人類下丘腦發(fā)育中沿前后軸顯示出空間發(fā)育不同步性（圖?5F-5J）。Cell?Chat細(xì)胞通訊分析，確定了早期特異性信號(hào)，包括WNT、Hippo和相關(guān)的粘附分子，如整合膜蛋白通路（圖?5K和5L），明確了它們?cè)贕W12的早期膠質(zhì)生成過程中介導(dǎo)膠質(zhì)-神經(jīng)元相互作用。

7、哺乳動(dòng)物下丘腦膠質(zhì)細(xì)胞的不同轉(zhuǎn)錄模式

對(duì)3,500個(gè)高度可變的基因進(jìn)行scCoGAPS分析，發(fā)現(xiàn)了137個(gè)富集模式，主要的人類下丘腦細(xì)胞類型被映射到小鼠RNA-seq數(shù)據(jù)集中（圖?6A），發(fā)現(xiàn)大量人類特異性基因在下丘腦的主要細(xì)胞類型中特異性富集（圖?6B）。接下來，關(guān)注富含神經(jīng)元的高表達(dá)人類特異性基因，并進(jìn)一步明確這些基因在不同神經(jīng)元亞型中的表達(dá)（圖?6C）。DIRAS3在ARC的NPY+神經(jīng)元中表現(xiàn)出特異性表達(dá)，并在GW15后逐漸增加，這與NPY的時(shí)間表達(dá)模式相似（圖?6E）。
與小鼠相比，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞顯示出人類基因表達(dá)模式（圖6F），這種模式中的marker基因已在人類下丘腦的早期OPCs或OLs中特異性表達(dá)（圖?6G）。通過人類OL和神經(jīng)元細(xì)胞的互作分析，發(fā)現(xiàn)人類模式107中的子集基因參與早期OL-神經(jīng)元通信（圖?6H）。人類星形膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育從GW15開始，但在小鼠出生后2天開始（P2）（圖?6I），證明下丘腦星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的物種差異。為進(jìn)一步驗(yàn)證，在人類（GW17）和小鼠（P2）下丘腦中對(duì)HOPX和GFAP進(jìn)行了聯(lián)合染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HOPX+GFAP+星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型主要存在于人類中（圖?6K），表明不同星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型具有物種特異性。

研究結(jié)論

本研究分析了下丘腦主要細(xì)胞類型及其差異表達(dá)基因，還確定了編碼NP的重要調(diào)節(jié)因子。此外，也定義了在下丘腦神經(jīng)發(fā)生過程中占據(jù)特定細(xì)胞核的不同神經(jīng)元亞群的時(shí)空轉(zhuǎn)錄模式。并與小鼠OLs相比，確定了人類OLs相關(guān)的基因表達(dá)模式。此外，早期OL神經(jīng)元相互作用可能通過多種信號(hào)通路影響神經(jīng)元分化。綜上，本研究以單細(xì)胞分辨率提供了人類下丘腦發(fā)育中神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的全面分子圖譜，并闡明了人類下丘腦的時(shí)空組織和下丘腦核形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

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