非編碼 RNA（ncRNA）是指不通過編碼蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的RNA，研究較多的非編碼RNA包括lncRNA、miRNA、circRNA等。近日Cell期刊中發(fā)表了一篇關(guān)于ncRNA的綜述，題為”Small and long non-coding RNAs: Past, present, and future[1]”,詳細(xì)說明了兩種常見的非編碼RNA（lncRNA和miRNA）的研究歷程、作用方式等進(jìn)行了詳細(xì)描述，包括對小RNA作為轉(zhuǎn)錄后阻遏因子的作用機(jī)制，以及以XIST、NEAT1等為例說明了lncRNA的順式反式調(diào)控，以及與RNA結(jié)合蛋白 （RBP）的相互作用等調(diào)控方式。作者認(rèn)為，盡管小RNA的研究在近30年來已取得了豐富的研究結(jié)果，但關(guān)于新的ncRNA的種類、修飾以及在單分子和高分辨率水平上的研究一定會帶來其他激動人心的研究成果。

本期為各位老師帶來一篇關(guān)于小RNA及l(fā)ncRNA研究的高分經(jīng)典案例解讀，希望能為各位老師后續(xù)研究激發(fā)新的研究思路~

中文題目：Klotho衍生肽1通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控恢復(fù)Klotho表達(dá)抑制纖維化腎臟細(xì)胞衰老

英文題目：Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation[2]

合作單位：南方醫(yī)科大學(xué)

發(fā)表期刊：Theranostics?

影響因子：12.4

百邁客生物為該研究提供了miRNA測序服務(wù)。

研究背景

慢性腎病（CKD）是一種持續(xù) 3 個月以上的腎功能不全病癥，特征通常是細(xì)胞衰老增加、表觀遺傳重編程、持續(xù)的成纖維細(xì)胞活化和持續(xù)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）產(chǎn)生，與老年腎臟存在很多相似之處，因此，CKD現(xiàn)在被認(rèn)為是一種腎臟過早和加速衰老的狀態(tài)?？顾ダ系鞍?Klotho 屬于由α和β亞型組成的單跨膜蛋白小家族，腎損傷會導(dǎo)致Klotho表達(dá)下調(diào)，Klotho 缺乏可導(dǎo)致高磷血癥、腎小管細(xì)胞衰老和腎纖維化等，進(jìn)一步加速 CKD的進(jìn)展，因此Klotho 被認(rèn)為是腎臟疾病診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

然而由于Klotho 是一種大型跨膜蛋白，臨床生產(chǎn)成本高且難度大，因此作者團(tuán)隊在前期報道了Klotho衍生肽1（KP1） 的發(fā)現(xiàn)，可通過結(jié)合TGF-β 受體2（TβR2） 并抑制 TGF-β/Smad3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來減輕腎纖維化，且生產(chǎn)上會更便捷經(jīng)濟(jì)，有可能替代 Klotho 進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化，為了進(jìn)一步研究 KP1 在保護(hù)腎臟中的作用，作者在本篇研究中檢查了其對細(xì)胞衰老的影響。

材料方法

材料：8-10周齡雄性C57BL/6小鼠假手術(shù)組（sham）、單側(cè)缺血再灌注損傷（UIRI）組別小鼠和治療組別小鼠（UIRI + KP1）共三組小鼠腎臟組織；

方法：miRNA測序+雙熒光素酶報告基因檢測+RNA 熒光原位雜交等

研究結(jié)果

WB檢測了許多細(xì)胞衰老標(biāo)志物如p21、p16和γ-H2AX的表達(dá)，結(jié)果表明了UIRI 誘導(dǎo)纖維化腎中對應(yīng)標(biāo)志物的表達(dá)，而KP1明顯消除了這種誘導(dǎo)。此外針對其內(nèi)源Klotho 的檢測也證明UIRI 導(dǎo)致腎臟中Klotho 的丟失而KP1在很大程度上恢復(fù)了它們的表達(dá)，單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）誘導(dǎo)的 CKD 模型以及體外細(xì)胞模型中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，此外，UIRI 還導(dǎo)致 Klotho mRNA 的顯著下調(diào)。然而，KP1 不影響 Klotho mRNA 的穩(wěn)態(tài)水平，說明KP1通過獨(dú)立于轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制誘導(dǎo) Klotho。

此外，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行的細(xì)胞周期分析表明，TGF-β1 孵育后的衰老原代腎小管細(xì)胞停滯在 G1 期，這被 KP1 處理抵消，證明了KP1阻斷細(xì)胞衰老的能力，而在可以阻斷新mRNA合成的放線菌素D（ActD）存在下與 TGF-β1 孵育后 12 小時和 24 小時，KP1 不會影響 Klotho mRNA 水平，進(jìn)一步證實(shí)了 KP1 誘導(dǎo) Klotho 蛋白表達(dá)而不影響其mRNA和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。

由于 KP1 不影響 Klotho mRNA 水平和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，作者開始探索 KP1 是否通過miRNA調(diào)節(jié) Klotho 蛋白，在 UIRI 腎臟中鑒定到了68個上調(diào)miRNA，在注射 KP1 后恢復(fù)到基線，其中 10 個與 Klotho mRNA 的 3′-UTR 特異性結(jié)合，其中miR-223-3p表現(xiàn)非常明顯，且在對公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析后發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 與 Klotho 水平呈負(fù)相關(guān)，支持了 miR-223-3p 與 Klotho 調(diào)節(jié)的相關(guān)性。

為了證實(shí) miR-223-3p 在 Klotho 表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用，作者進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因測定，轉(zhuǎn)染 miR-223-3p 模擬物降低了含有野生型未突變型 Klotho mRNA 序列的報告基因的熒光素酶活性，表明 miR-223-3p 可以特異性靶向 Klotho mRNA，抑制其活性，用miR-223-3p轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞進(jìn)一步證明miR-223-3p抑制 HK-2 細(xì)胞中 Klotho 蛋白的表達(dá)。體內(nèi)模型原位雜交驗證了miR-223-3p 在 UIRI 腎腎小管上皮中被誘導(dǎo)，而KP1抑制了miR-223-3p表達(dá)，結(jié)合免疫熒光染色結(jié)果證明了KP1 可以通過在體內(nèi)抑制 miR-223-3p 來恢復(fù) Klotho 表達(dá)，在體外的HK-2 細(xì)胞中的miR-223-3p及其拮抗劑轉(zhuǎn)染實(shí)驗也呈現(xiàn)出了相同的結(jié)果。

為了進(jìn)一步驗證實(shí)驗結(jié)果，作者對小鼠模型靜脈注釋miR-223-3p 表達(dá)質(zhì)粒和 KP1構(gòu)建體內(nèi)表達(dá)模型，結(jié)果顯示，miR-223-3p 的過表達(dá)加劇了 p16 、 γ-H2AX 、纖連蛋白、 I 型膠原和 α-SMA 的表達(dá)，所有這些都被 KP1 抑制，而miR-223-3p拮抗素的注射同樣消除了 UIRI 小鼠中的 p21、p16 和 γ-H2AX、纖連蛋白、膠原蛋白 I 和 α-SMA，恢復(fù)了腎功能。而 KP1、SB431542 （TβR1/2 抑制劑） 和 SIS3 （p-Smad3 抑制劑） 處理 TGF-β1 刺激的 HK-2 細(xì)胞結(jié)果進(jìn)一步闡明了，KP1 通過阻斷 TGF-β1/Smad3/miR-223-3p 信號傳導(dǎo)來恢復(fù) Klotho 表達(dá)并防止細(xì)胞衰老。

由于 miRNAs 和 lncRNAs 經(jīng)常相互作用并相互調(diào)節(jié)，作者搜索了幾個 lncRNA-miRNA 相互作用數(shù)據(jù)庫，并預(yù)測 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 （牛磺酸上調(diào)基因 1） 具有推定的結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報告基因測定驗證了miR-223-3p 降低了野生型TUG1報告基因的熒光素酶活性，且在 HK-2 細(xì)胞中過表達(dá) miR-223-3p 抑制了 lncRNA-TUG1，而KP1則消除了這個效果，TGF-β1抑制了HK-2細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-TUG1的表達(dá)，而KP1、SB43154或SIS3則消除了此類效果，這些結(jié)果表明lncRNA-TUG1受TGF-β/Smad信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)。而LncRNA-TUG1 沉默也降低了 Klotho 蛋白，但沒有降低其 mRNA 水平，說明miR-223-3p 可以與 lncRNA-TUG1 相互作用，形成競爭性內(nèi)源性 RNA （ceRNA） 網(wǎng)絡(luò)，從而放大其在調(diào)節(jié) Klotho 表達(dá)和細(xì)胞衰老中的作用。體內(nèi)UUO和UIRI 模型中都驗證了這一點(diǎn)。

綜上所述，miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 協(xié)同工作，導(dǎo)致 Klotho 丟失、細(xì)胞衰老和腎纖維化，所有這些都被 KP1 緩解。KP1 是一種新發(fā)現(xiàn)的 Klotho 衍生肽，通過恢復(fù) Klotho 表達(dá)來抑制細(xì)胞衰老，KP1 的這種作用由 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)運(yùn)作。通過恢復(fù) Klotho 表達(dá)，KP1 充當(dāng) Klotho 誘導(dǎo)劑，并具有廣泛的腎保護(hù)特性，例如抗氧化、抗衰老和干細(xì)胞保護(hù)，有望將KP1轉(zhuǎn)化為 CKD 患者的臨床治療。

思路發(fā)散

本研究中利用miRNA測序、公共lncRNA數(shù)據(jù)庫以及公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集共同分析出了miRNA與lncRNA共同構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)的作用機(jī)制，對于較新的研究來說，可以直接通過全轉(zhuǎn)錄組，利用同一來源組織構(gòu)建兩個文庫（lncRNA及小RNA文庫）得到包括lncRNA、miRNA、mRNA以及circRNA的結(jié)果，由此可分析出更可靠的相關(guān)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，便于篩選關(guān)鍵非編碼RNA。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: Past, present, and future.Cell. 2024 Nov 14;187(23):6451-6485. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.024. PMID:39547208.

[2] Zhang X, Li L, Tan H, Hong X, Yuan Q, Hou FF, Zhou L, Liu Y. Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation. Theranostics. 2024 Jan 1;14(1):420-435. doi: 10.7150/thno.89105. PMID: 38164143; PMCID: PMC10750200.