1、提取方法
- 樣本研磨
- 將裝有樣品的離心管加入1 ml 65 ℃預熱的CTAB提取液和2%的巰基乙醇（如 果是動物組織的話加50ul濃度為20mg/ml的蛋白酶K），在渦旋振蕩儀上震蕩混勻，使樣品完全懸浮，65 ℃烘箱溫浴40 -60min，不能超過1h
- 溫浴期間搖勻2-3次，保證裂解充分。取出后，冷卻至室溫
- 12000 rpm離心5 min，取上清液900ul至新的0 ml 無菌離心管中（。加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min
- 吸取上清液700 ul至新的0 ml 無菌離心管，加入等體積三氯甲烷-異戊醇 （24:1），上下顛倒混勻， 12000 rpm離心20 min
- 吸取上清液450 ul至新的5 ml無菌離心管中，加入上清液體積的2/3體積（300ul）的異丙醇和1/10體積（45ul）的3M乙酸鈉，充分混勻，-20 ℃放置1 h
- 12000rpm離心10min（如果從-20℃取出后絮狀沉淀較多，可12000rpm離心20s），棄上清，瞬時離心，用200ul槍頭吸棄多余液體
- 向沉淀中加1ml 75%的乙醇溶液，輕彈至沉淀懸浮，12000rpm離心5min，棄上清
- 瞬時離心，用黃槍頭吸棄多余液體，離心管開蓋室溫晾干3-5min至DNA沉淀呈半透明狀
- 加入≥20 ul含10 ng/ul RnaseA的超純水，根據(jù)沉淀大小決定融水體積，溶解DNA沉淀，37 ℃水浴鍋消化1 h后保存在-20 ℃冰箱備用
注：常規(guī)植物組織提取正常使用CTAB提取，疑難植物（薔薇科等多糖類植物）組織裂解前使用干擾（清洗掉部分多糖等雜質(zhì)）先清洗，清洗完之后在加裂解液；動物組織在裂解時加入2%的蛋白酶K；宏基因組項目提取在裂解時加入5%-10%的溶菌酶
2、檢測方法
2.1?檢測方法
使用?Qubit（廠家YEASEN, 型號CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit ?）檢測核酸濃度，使用1%的瓊脂糖電泳檢測完整性
2.2?判定標準
- 濃度≥1.25ng/ul
- 總量大于等于?10ng
- 完整性主帶清晰、主帶不清晰，輕微拖帶在2K以上
- 核酸狀態(tài)正常
3、建庫方法
3.1?基因組打斷
- 取適量基因組DNA至6mL進口離心管，混入1%的lambda DNA
- 使用Bioruptor Pico，根據(jù)核酸質(zhì)量情況設置好打斷參數(shù)，進行超聲波打斷
3.2?打斷產(chǎn)物純化
- 加入適量體積的Vazyme DNA Beads至打斷后的DNA中，吹吸混勻，室溫靜置5min，瞬時離心
- 置于磁力架上，靜置5min，移棄上清液
- 加入新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液；連續(xù)清洗2次后瞬時離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
- 離心管置于磁力架上，打開管蓋，室溫干燥至磁珠表面無光澤，有細微裂紋
- 取下離心管，加入無菌水，吹吸混勻，室溫靜置，而后磁力架上靜置，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的2mL PCR 管中
3.3?亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化
- 將CT Conversion Mix平衡至室溫并渦旋混勻，于Nuclease-free PCR管中加入CT Conversion Mix和Input DNA
- 渦旋或者吹打混勻后短暫離心，將反應液收集至管底
- 將PCR管置于PCR儀中，設置好程序運行
3.4?轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純化
- 將E-Binding Buffer加入至EpiArt DNA Columns (each in a 2 ml Collection Tube)，將轉(zhuǎn)化后的反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至EpiArt DNA Columns。溫和地上下顛倒混勻6 – 8次，使反應產(chǎn)物與E-Binding Buffer完全混勻，離心
- 棄濾液，沿管壁加入100 μl E-Wash Buffer 至EpiArt DNA Columns，離心
- 沿管壁加入E-Desulphonation Buffer至EpiArt DNA Columns，室溫(15 ~ 25℃)下靜置反應15 min，離心
- 沿管壁加入 E-Wash Buffer至EpiArt DNA Columns，離心
- 重復步驟4，棄濾液，空柱離心將多余的廢液離心至管底
- 棄EpiArt DNA Columns，將DNA產(chǎn)物轉(zhuǎn)入新的2mLPCR管，產(chǎn)物保存于-30 ~ -15℃，長期保存需放置于-85 ~ -65℃，以防降解
3.5?轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加接頭
- 預熱PCR儀：熱蓋設為105℃，反應溫度設置為95℃。在5 mL離心管管中配制好后續(xù)反應試劑，用移液器輕輕吹打混勻后置于冰上待用
- 將上一步驟轉(zhuǎn)化純化產(chǎn)物瞬時離心，置于預熱的PCR儀上，95℃加熱2 min ，迅速置于冰上靜置2 min。DNA變性后立即置于冰上，避免已變性為單鏈的DNA慢慢復性
- 室溫解凍3′ Ligation Buffer 、3′ Ligation Enzyme Mix和3’Adapter，上下顛倒混勻后備用
- 在5mL離心管中配制如下3’Adapter Ligation預混液（步驟3解凍的試劑）
- 將3′ Adapter Ligation預混液與已變性的DNA用移液器輕輕吹打混勻后短暫離心，將反應液收集至管底
- 將反應管置于PCR儀中，設置好程序運行
3.6?單鏈DNA延伸
- 室溫解凍Extension Primer和Extension Enzyme Mix，上下顛倒混勻后備用
- 于上一步驟反應管中加入延伸試劑Extension Primer、Extension Enzyme Mix
- 使用移液器輕輕吹打混勻后瞬時離心，將反應液收集至管底
- 將PCR管置于PCR儀中，按照程序運行
3.7?反應產(chǎn)物純化
- 瞬時離心連接反應管，加入2x的Vazyme DNA Beads，輕輕吹吸10次充分混勻
- 室溫孵育5min，而后置于磁力架上，靜置5min，小心移除上清，避免接觸并吸取磁珠
- 保持反應管始終置于磁力架中，用排槍向反應管中加入新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液
- 重復步驟（4）一次，第二次清洗后，瞬時離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
- 反應管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色變?yōu)槟ド昂稚?/li>
- 將反應管從磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脫DNA，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力架上靜置5min，小心吸取上清至新的PCR管中
3.8?5’端連接接頭
- 室溫解凍5′ Ligation Mix和5′ Adapter，上下顛倒混勻后備用
- 于上一步驟反應管中配制如解凍后的試劑，使用移液器輕輕吹打混勻后瞬時離心，將反應液收集至管底
- 將PCR管置于PCR儀中，按照程序運行
- 反應產(chǎn)物純化，同步驟7
3.9?片段篩選
- 向上述純化后的PCR管中加入5×已混勻的磁珠，吹吸10次混勻，室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，靜置5 min，吸取全部上清液至新的PCR管中
- 加入15×已混勻的磁珠，吹吸10次混勻。室溫孵育5 min；而后置于磁力架上，靜置5 min，移棄上清液
- 加入100 μL新鮮配制的80%乙醇清洗磁珠（不可對著磁珠吹吸），磁力架上靜置30s，移棄上清液
- 重復上步驟一次，第二次清洗后用10 μL槍頭將上清液徹底去除干凈
- PCR管置于磁力架上，打開管蓋，室溫干燥1 min；取下PCR管，加入nuclease-free water，吹吸10~15次混勻，室溫靜置5 min；而后磁力架上靜置5 min，吸取上清液轉(zhuǎn)入新的PCR管中
3.10?PCR 擴增
- 將VAHTS HiFi Amplification Mix V3和Index Primers*解凍后顛倒混勻，加入上一步驟反應管中
- 混勻，瞬時離心，置于PCR儀中按照程序運
3.11?PCR產(chǎn)物純化
- 瞬時離心連接反應管，補加25ul ddH2O，吹洗混勻后加入65 x的Vazyme DNA Beads，輕輕吹吸充分混勻
- 室溫孵育5min，而后置于磁力架上，靜置5min，小心移除上清，避免接觸并吸取磁珠
- 保持反應管始終置于磁力架中，向反應管中加入200μL新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液
- 重復步驟3）一次，第二次清洗后，瞬時離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
- 反應管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色變?yōu)槟ド昂稚?/li>
- 將反應管從磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脫DNA，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力架上靜置5min，小心吸取上清至新的PCR管中
- 重復上述純化步驟進行二次純化。加入65 x的Vazyme DNA Beads，輕輕吹吸充分混勻
- 室溫孵育5min，而后置于磁力架上，靜置5min，小心移除上清，避免接觸并吸取磁珠
- 保持反應管始終置于磁力架中，向反應管中加入200μL新鮮配制的80%乙醇，磁力架上靜置30s，移棄上清液
- 重復步驟（10）一次，第二次清洗后，瞬時離心，用10μL槍頭將上清液去除干凈
- 反應管置于磁力架上，打開管蓋，空氣干燥1-2min，磁珠表面由光亮褐色變?yōu)槟ド昂稚?/li>
- 將反應管從磁力架上取出，加入Dilution Buffer洗脫DNA，吹吸六次混勻，室溫靜置5min，而后磁力架上靜置5min，小心吸取30 μL上清至新的PCR管中
- 分裝2ulGX檢測
3.12?文庫質(zhì)檢
- 質(zhì)檢方法：文庫通過Qsep-400進行片段質(zhì)檢，?使用?Qubit?3?.0進行文庫濃度的定量
- 質(zhì)檢標準：濃度≥1ng/ul，峰圖在要求切膠范圍之內(nèi)，片段單一無雜峰
3.13?建庫試劑耗材
- 文庫構(gòu)建試劑盒：EpiArt DNA Enzymatic MethyLation Kit，貨號EM301-00；EpiArt DNA Methylartion Library Kit For Illumina V，貨號NE103-00
- 產(chǎn)物純化磁珠：VAHTSTMDNA?Clean?Beads，?貨號N411-03
- 質(zhì)檢使用試劑：Qsep400 ?標準DNA卡夾
- 定量使用試劑：Qubit TM dsDNA HS Assay Ki
- 5ml離心管、0.2mlPCR管、10ul，200ul槍頭：Axygen
3.14?建庫設備
| 設備 | 廠家 |
| PCR儀 | 艾本德 |
| 金屬浴 | 天根 |
| 掌上離心機 | 天根生化 |
| 漩渦震蕩器 | SCIENTIFICINDUSTRIES.INC |
| 移液槍 | RAININ 瑞寧 |
| 磁力架 | Life |
| 相機 | 索尼 |
| 冰箱 | 海爾 |
| 四維旋轉(zhuǎn)儀 | 海門市其林貝爾儀器制造有限公司 |
| 質(zhì)檢使用儀器 | Bioptic-Qsep400 |
| 定量使用儀器 | 賽默飛Qubit 3.0 |
| 超聲波破碎儀 | Bioruptor Pico非接觸式全自動超聲波破碎儀、Diagenode |
| 水浴鍋 | 北京三二八科學儀器有限公司 |
4、測序方法
測序設備：NovaSeq X plus
測序試劑盒：NovaSeqTMX? Series25B Rgt Kit
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